豆芽中生長調節劑類違禁添加物的檢測方法研究進展

孟繼秋 曹金博 孫亞寧 胡驍飛 李兆周 陳秀金 鄧瑞廣 王 耀

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003；2. 河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002)

豆芽作為一種營養豐富的蔬菜，食用方便，價格低廉，因而受到廣大消費者的喜愛[1]。豆芽在生長過程中會產生大量的酚類和黃酮類等物質，營養價值高和抗氧化能力強[2]。隨著中國芽菜產業迅速發展，“問題豆芽”事件頻發[3]，植物生長調節劑的危害也逐漸引起了人們的關注及熱議，為確保豆芽及其制品食用安全，根據《中華人民共和國食品安全法》《中華人民共和國農產品質量安全法》等相關法律的規定，原國家食品藥品監督管理總局、農業部、國家衛生和計劃生育委員會在2015年發布公告，嚴禁在豆芽生產過程中使用6-芐基腺嘌呤等植物生長調節劑類物質。2018年美國也將6-芐基腺嘌呤在水果蔬菜中的最低限量下調至0.01 μg/g。因此，為了滿足食品安全監管的需要，豆芽中生長調節劑檢測方法的研究備受重視。文章擬介紹豆芽中常見違禁添加的生長調節劑的作用與危害，并對國內外目前應用較為廣泛的檢測方法進行綜述，以期為豆芽中生長調節劑檢測方法的深入研究提供參考。

1 豆芽中主要生長調節劑的作用及危害

豆芽生產過程中違法添加的植物生長調節劑主要有6-芐基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)、4-氯苯氧乙酸鈉(Sodium 4-Chlorophenoxyacetate，4-CPANa)以及2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D)，其分子結構式如圖1所示。6-BA是第一個人工合成的腺嘌呤型細胞分裂素，廣泛應用于水果和蔬菜中，可有效增產保鮮，提高質量，延長貨架壽命[4]。6-BA還可抑制根的生長，有研究表明，用0.5～25.0 mg/L的濃度處理豆芽可以使其色澤光亮、口感酥脆[5]，并縮短其生長周期[6]。然而6-BA的濫用，不僅使其大量殘留于食品中，威脅人身健康[7]，同時也污染環境。6-BA的毒性主要表現在損害生殖系統和神經系統，甚至導致性早熟、急性中毒和癌癥[8]。4-CPANa又稱防落素，是一種內吸、廣譜、高效、多功能植物生長調節劑[9]，作為植物生長調節劑使用時，可抑制豆芽生根、促進生長[10]。其在體內大量蓄積，可誘發肝腎衰竭，心臟腫大，肺部淤血等癥狀[11]。此外，有研究[12]表明，4-CPANa在不改變血液中激素水平的條件下，可誘導大鼠性腺細胞凋亡。2，4-D是一種苯氧化合物，高濃度時常用作除草劑，低濃度時用作細胞分裂素[13]，用于豆芽的生產時，能縮短發芽期，促進產量，減少須根比例[14]。其在體內的蓄積毒性主要表現為急性充血、內分泌紊亂、中樞神經退化甚至癌癥的發生[15]。植物生長調節劑在豆芽中的違規濫用，不僅使其大量殘留在豆芽中，同時也隨水體、土壤等途徑污染環境。

(a) 6-芐基氨基嘌呤 (b) 4-氯苯氧乙酸鈉 (c) 2,4-二氯苯氧乙酸

圖1 豆芽中主要生長調節劑分子結構式

Figure 1 Molecular formulae of main growth regulators in bean sprouts

2 主要檢測方法

目前應用于豆芽中植物生長調節劑的檢測方法主要有高效液相色譜法、表面增強拉曼光譜法、電化學方法、免疫分析方法、生物傳感器等方法。

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)是一種最常用的色譜分析技術，適用于測定農獸藥殘留及各種小分子分析物。其檢測原理主要是根據待檢樣品中各成分極性的不同，在色譜柱流動過程中將其分離，并在檢測器中分別進行分析[16]。Wang等[17]建立了一種以氧化石墨烯/聚吡咯為吸附劑的高效液相色譜方法對豆芽中6-BA進行了檢測，結果表明該方法在44～2 200 ng/g范圍內具有良好的線性關系，線性相關系數為0.999 8，回收率在92.5%～103.7%，此吸附劑具有理想的泡沫形貌，不僅保持了石墨烯的層狀結構，而且結塊較少，大大提高了檢測的靈敏度。而Nian等[18]以聚[2-(二甲胺基)甲基丙烯酸乙酯-二甲基丙烯酸乙酯]為固相萃取吸附劑所建立的4-CPANa檢測方法，其線性區間為0.2～50.0 ng/mL，回收率為75.0%～93.3%，檢測限為1 ng/mL，此方法自動化程度和吸附劑重復使用率高，既節省檢測時間又降低檢測成本。劉春生等[19]建立了超高效液相色譜—串聯三重四極桿質譜法檢測豆芽中6-BA與4-CPANa，其檢測結果在0.4～100.0 ng/mL區間具有良好的線性關系，檢測限分別為0.6，0.9 ng/mL，回收率為80.7%～115.0%。該方法雖然分辨率高、選擇性強、假陽性和假陰性率低，檢測準確度高，但也存在儀器昂貴和操作繁瑣等弊端。

2.2 表面增強拉曼光譜法

表面增強拉曼光譜法(surface-enhanced raman spectroscopy，SERS)是一種高度靈敏的分析檢測技術，其原理為吸附在貴金屬納米粒子表面的目標分子在激光的作用下受到局域電場的激發而產生拉曼散射[20]，由于其具有較高的信號增強因子，能達到百萬級的光譜增強能力，可以在分子水平提供光譜信息，通常用于痕量分析和檢測[21-22]。張萍等[23]采用快速溶劑提取前處理技術與SERS檢測技術建立豆芽中6-BA殘留物的快速定量檢測方法，其結果在0.1～2.0 μg/mL范圍內呈現良好的線性關系，檢測限為20 ng/mL，回收率為82.3%～95.1%，此方法采用快速溶劑提取的前處理技術，縮短檢測耗時，提高檢測效率。Wang等[24]利用納米銀作為載體建立SERS檢測方法用于檢測豆芽中的6-BA，線性范圍為10～200 ng/mL，檢測限為3.3 ng/mL，回收率為85.5%～113.0%，借助納米金屬粒子，使該方法檢測限更低。Zhang等[25]開發出一種便攜式表面增強拉曼光譜儀，可用于現場快速檢測豆芽中6-BA殘留，該方法檢測線性范圍為0.1～5.0 μg/mL，檢測限為0.04 μg/g，回收率為81.7%～95.0%，由于其便攜性可直接用于現場檢測，使檢測過程更加簡單、快捷。

2.3 電化學方法

電化學方法是根據不同物質的電化學特性差異，通過測定溶液中的電流、電位等電信號參數，判斷被測物成分及含量的一種分析方法[26]，靈敏度高、成本低，反應速度快、試劑用量少、操作簡單、儀器使用方便，已被廣泛應用于各個領域[27]，但大多數電極材料對植物生長調節劑的氧化還原沒有催化能力或催化能力較差，復雜電化學行為以及電氧化和電聚合還會導致強電極鈍化(結垢)[28]。因此，為了檢測豆芽中的生長調節劑，現多致力于研究和開發新型電極材料。Zhu等[29]開發出一種液體基石墨烯分子印跡聚合物，對6-BA具有較高的催化活性和吸附能力，在優化條件下，電流與6-BA線性關系范圍為0.5～50.0 μmol/L，檢測限為0.2 μmol/L，回收率為97.3%～108.0%，此方法使用的離子基液體交聯劑具有良好的電催化性能，顯著提高檢測的靈敏度和穩定性。Gan等[30]合成出一種CuO@SiO2空心殼結構，電化學測試結果表明其對6-BA有良好的電催化活性，并以此建立了一種簡單、快速的豆芽中6-BA檢測方法，峰值電流與6-BA的濃度在50 nmol/L～100 μmol/L范圍內呈良好的線性關系，檢測限為2.6 nmol/L，回收率為97.2%～107.0%，此材料簡單易得、堆積效率高，既縮短檢測時間又降低檢測成本。Gan等[31]通過將多壁碳納米管與分子印跡殼聚糖充分混合，然后覆蓋在玻碳電極表面，制備了納米管，在優化條件下，線性范圍濃度為0.1 nmol/L～10.0 mmol/L，檢測限為50 pmol/L，回收率為91%～103%，此材料會為6-BA提供更多的結合位點，以此材料制備的電極來檢測豆芽中的6-BA，受基質效應影響較小，靈敏度更高，檢測結果更加準確。

2.4 免疫分析方法

免疫分析方法是基于抗原和抗體之間的特異性識別，利用酶、放射性同位素、熒光素等材料對抗原或抗體進行標記所建立的一種快速檢測方法[32]，主要包括酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫印跡(immunoblotting)、免疫層析(immunochromatographic assay，ICA)等，該類方法靈敏度高、特異性強且操作簡單，但抗體制備周期較長且高親和抗體篩選難度大[33]。Zhang等[34]利用6-BA的代謝產物6-芐基腺苷(6-benzylaminopurine riboside，6-BAR)合成免疫原，通過免疫小鼠最終制備能同時特異性識別6-BAR和6-BA的單克隆抗體，并基于此抗體建立了6-BA的間接競爭ELISA檢測方法，該方法的線性范圍為3.6～106.0 ng/mL，半數抑制濃度(IC50)為18.9 ng/mL，回收率為104%～109%，在豆芽生長后期，部分6-BA已經代謝為6-BAR，此方法亦可通過檢測6-BAR間接反映是否添加6-BA。Wang等[35]將SiO2納米材料結合在包被原上建立了一種直接競爭ELISA方法用于檢測豆芽中2，4-D殘留，該方法線性范圍為1～350 ng/mL，檢測限為0.079 ng/mL，平均回收率為93.2%，SiO2納米材料的使用可有效提高檢測靈敏度，降低檢測限。Li等[36]基于單克隆抗體開發出一種用于快速檢測豆芽中6-BA的膠體金免疫層析試紙，該抗體的IC50為2.25 ng/mL，試紙的檢測范圍為10～80 ng/mL，該方法不但操作簡單，而且在短時間內便可得到肉眼可見的結果，適合豆芽中6-BA的現場快速篩查。

2.5 生物傳感器

生物傳感器最早于1962年由Clark和Lyons最先提出和使用，主要包括生物識別單元和換能器兩個重要組成部分[37]，其原理是將具有特異性識別能力的生物材料固定在固相載體上，形成功能膜，當膜與被測物質接觸時，敏感物質首先與被測物質發生選擇性吸附，然后發生一系列反應，并將結果轉化為電信號，最后由儀器將檢測結果直觀地表現出來[38]。根據生物敏感單元的不同主要可分為酶傳感器、免疫傳感器、微生物細胞傳感器等[39]，此方法具有敏感性強，準確性高等特點[40]。Lee等[41]利用非標記的光流環諧振器(opto-fluidic ring resonator，OFRR)建立免疫傳感器對豆芽中6-BA進行檢測，通過優化OFRR毛細管和錐形光纜的制備工藝，制備了納米級別的OFRR生物傳感器，并用金納米粒子與6-BA抗體結合，通過直接夾心法使檢測限降至10 ng/mL。Liu等[42]研究發現2，4-D具有抑制過氧化氫酶的能力，并基于這種抑制能力建立一種2，4-D的快速檢測方法，該方法將過氧化氫酶固定于多孔磷酸鈣納米材料上，將2，4-D與過氧化氫同時注入反應體系，由于2，4-D的抑制作用使得過氧化氫的還原電流降低，還原電流與2，4-D濃度在6.63～663.00 ng/mL內呈線性關系，檢測限為3.3 ng/mL，該方法準確性好且重復性高。Paolo等[43]利用2，4-D對堿性磷酸酶的抑制作用原理，開發了一種快速、簡單、廉價的檢測2，4-D的生物傳感器，在優化條件下，該傳感器的線性范圍為2.1～110.0 ng/mL，檢測限為1.0 ng/mL，添加回收試驗結果表明運用該傳感器檢測2，4-D具有良好的重現性，此方法所使用的酶傳感器相較于免疫傳感器具有成本低廉，重復使用率高等特點，整體檢測性能更為優異。

3 展望

高效液相色譜、表面增強拉曼光譜等傳統的儀器檢測方法具有檢測限低、準確度高、重復性好等優勢，在實驗室確證檢測中得到了廣泛應用，但這些方法仍存在儀器價格昂貴、操作繁瑣等弊端，且目前便攜式檢測裝備的研發仍較為缺乏。因此，未來仍須開發簡便、快速、靈敏、特異的檢測方法，以滿足大批量樣品快速篩查的需求。相比之下，免疫分析方法和生物傳感器法利用高親和力或強敏感性識別物對目標物進行快速識別，特異性強、靈敏度高且操作簡便，在大批量樣品的現場快速篩查方面具有極大的優勢，若進一步將多種檢測手段相互融合，優化檢測條件，提高方法準確度和穩定性，并探索利用廣譜性識別物建立高靈敏的多殘留檢測方法，將對植物生長調節劑違法濫用情況的高效監控提供有力保障。