免疫力低下小鼠動(dòng)物模型建立及快速檢測(cè)研究

田嘉軍，黃聘和，岳茜嵐，何其勵(lì)

(四川省疾病預(yù)防控制中心，成都 610041)

在市售提高免疫力功能的保健食品中，絕大部分產(chǎn)品提及適用人群是免疫力低下的人群，然而在《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(以下簡(jiǎn)稱《規(guī)范》)中，保健食品中的增強(qiáng)免疫力功能試驗(yàn)只設(shè)了陰性對(duì)照組動(dòng)物，建議必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。陰性對(duì)照組動(dòng)物只需蒸餾水灌胃，不做其他處理，我們可以理解為正常免疫力功能的動(dòng)物。這樣往往與檢測(cè)樣品的最終目的不同，因?yàn)橛性S多保健食品的保健功能是針對(duì)免疫力低下的人群。因此，免疫力低下小鼠動(dòng)物模型的建立，將陽(yáng)性對(duì)照加入到試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物就是免疫力低下動(dòng)物組，相對(duì)于正常免疫力動(dòng)物組，對(duì)完善增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)試驗(yàn)具有重大意義，這一動(dòng)物模型的建立，對(duì)以后《規(guī)范》里增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)試驗(yàn)是否添加陽(yáng)性對(duì)照積累原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

怎樣制造動(dòng)物免疫力低下、怎樣快速驗(yàn)證動(dòng)物模型成立，這是本文的目的。但在《規(guī)范》根本沒(méi)有涉及這些方面的內(nèi)容，免疫力低下動(dòng)物摸型和評(píng)判指標(biāo)也沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)可查。因此，本研究通過(guò)四種處理方法，對(duì)比尋找出快速有效建立免疫力低下的小鼠動(dòng)物模型，并篩選部分檢測(cè)指標(biāo)快速確定動(dòng)物模型是否成立。提出簡(jiǎn)單可靠的檢測(cè)指標(biāo)，也是本研究的創(chuàng)新點(diǎn)之一。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的KM小鼠，6～8周齡100只，全雌，體重18～22 g，SPF級(jí)，[SCXK(川)2018-19]；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房為屏障系統(tǒng)，[SYXK(川)2016-043]。溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。本研究所有動(dòng)物試驗(yàn)，嚴(yán)格按照“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南”進(jìn)行，過(guò)程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給與人道關(guān)懷，并經(jīng)四川省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SCCDCDWLL2017007)。

1.2 主要試劑與儀器

環(huán)磷酰胺：江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：16112625。氫化可的松：武漢福鑫化工有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：170823。無(wú)水乙醇：成都金山化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170426。小鼠免疫球蛋白A、G、M ELISA檢測(cè)試劑盒:均由深圳子科生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)均為：201709。流式細(xì)胞儀(BD_FACSCalibur，貝克曼公司，美國(guó))。全自動(dòng)血液分析儀(SYSMEX XT-2000i型，奧林巴斯公司，日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

將100只全雌KM小鼠隨機(jī)分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組五個(gè)組，各組20只；每組又分成A、B兩部分，每部分為10只。

1.3.2 動(dòng)物給藥途徑及劑量

Ⅰ組：環(huán)磷酰胺經(jīng)口灌胃，劑量為100 mg/kg[1-3]，連續(xù)3 d；Ⅱ組：氫化可的松經(jīng)口灌胃，劑量為80 mg/kg[4-6]，連續(xù)3 d；Ⅲ組：60%乙醇溶液經(jīng)口灌胃，劑量為20 mL/kg，連續(xù)3 d；Ⅳ組：UVA紫外線皮膚照射(長(zhǎng)波)，劑量為10 J/cm2，連續(xù)3 d，照射時(shí)間=(10 000 mJ/cm2)÷光強(qiáng)度；Ⅴ組：蒸餾水經(jīng)口灌胃，劑量為20 mL/Kg，連續(xù)3 d。

1.3.3 小鼠實(shí)驗(yàn)前后體重對(duì)比

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物引進(jìn)動(dòng)物房觀察3 d后，小鼠無(wú)異常，稱量各試驗(yàn)組小鼠體重，然后連續(xù)3 d給藥或處理，第4天取血前小鼠稱重[7-8]。

1.3.4 小鼠血清免疫球蛋白含量測(cè)定

在第4天結(jié)束實(shí)驗(yàn)后，各組A部分動(dòng)物取小鼠血至小玻璃試管中，水浴37℃，1 h，離心3000 r/min，5 min，取上層血清備用。用免疫球蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組小鼠血清中IGG、IGA、IGM的含量。

1.3.5 小鼠外周血測(cè)定

第4天結(jié)束實(shí)驗(yàn)后，各組B部分小鼠取血至含抗凝劑的小玻璃試管中，充分搖勻，制備抗凝血備用。用全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定小鼠外周血血常規(guī)指標(biāo)。用BD_FACSCalibur流式細(xì)胞儀測(cè)定小鼠全血中B淋巴細(xì)胞CD19、T淋巴細(xì)胞CD3的含量，并觀察CD19/CD3的比值情況[9-12]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠實(shí)驗(yàn)前后體重稱量結(jié)果

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物引進(jìn)動(dòng)物房觀察3 d后，進(jìn)行完全隨機(jī)分組，稱量實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后體重。從表1可見(jiàn)，環(huán)磷酰胺組(Ⅰ組)、氫化可的松(Ⅱ組)和60%乙醇溶液組(Ⅲ組)體重均較對(duì)照組(Ⅴ組)有明顯差異。特別是60%乙醇溶液組(Ⅲ組)小鼠，體重還有下降的趨勢(shì)，體重均值比實(shí)驗(yàn)前還低，3 d高濃度的乙醇連續(xù)灌胃，可能導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體功能損傷。環(huán)磷酰胺組(Ⅰ組)和氫化可的松(Ⅱ組)由于藥物作用，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)緩慢，動(dòng)物機(jī)體功能有一定的影響。紫外線皮膚照射組(Ⅳ組)體重基本沒(méi)有受到影響，估計(jì)在此強(qiáng)度下的紫外線照射對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠對(duì)機(jī)體損傷不大。

2.2 小鼠血清免疫球蛋白含量測(cè)定結(jié)果

按照小鼠免疫球蛋白檢測(cè)試劑盒的要求加入待檢血清樣10 μL,根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)量得到的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)品工作曲線，將各組待測(cè)血清測(cè)得的OD值按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。從表2可見(jiàn)，環(huán)磷酰胺組(Ⅰ組)和60%乙醇溶液組(Ⅲ組)小鼠血清IGG、IGA、IGM的含量較對(duì)照組有明顯下降。氫化可的松(Ⅱ組)小鼠血清IGG和IGA含量亦有下降，提示機(jī)體免疫能力有下降。紫外線皮膚照射組(Ⅳ組)三者測(cè)量值與對(duì)照組(Ⅴ組)比較未見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。

2.3 小鼠外周抗凝血血常規(guī)測(cè)定結(jié)果

選取白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、單核細(xì)胞絕對(duì)值7個(gè)血常規(guī)指標(biāo)作為觀察對(duì)象。環(huán)磷酰胺組(Ⅰ組)的白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、單核細(xì)胞絕對(duì)值6個(gè)指標(biāo)與對(duì)照組(Ⅴ組)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異；氫化可的松(Ⅱ組)的淋巴細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值2個(gè)指標(biāo)與對(duì)照組(Ⅴ組)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異；60%乙醇溶液組(Ⅲ組)的白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值4個(gè)指標(biāo)與對(duì)照組(Ⅴ組)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異；紫外線皮膚照射組(Ⅳ組)的淋巴細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值2個(gè)指標(biāo)與對(duì)照組(Ⅴ組)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。其余各組各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組(Ⅴ組)比較未見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(見(jiàn)表3)。

表1 小鼠試驗(yàn)前后體重

注：與Ⅴ組(空白對(duì)照組)比較,aP<0.01。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01.

表2 小鼠血清免疫球蛋白含量

注：與Ⅴ組(空白對(duì)照組)比較,aP<0.01,bP<0.05。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01,bP<0.05.

表3 小鼠實(shí)驗(yàn)后血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)

注：與Ⅴ組(空白對(duì)照組)比較,aP<0.01,bP<0.05。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01,bP<0.05.

2.4 小鼠外周抗凝血B淋巴細(xì)胞CD19、T淋巴細(xì)胞CD3含量測(cè)定結(jié)果

環(huán)磷酰胺組(Ⅰ組)的B淋巴細(xì)胞CD19、T淋巴細(xì)胞CD3含量有明顯下降，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組(見(jiàn)圖1)；氫化可的松(Ⅱ組)的B淋巴細(xì)胞CD19含量有減少，CD19/CD3比值與對(duì)照組(Ⅴ組)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異；60%乙醇溶液組(Ⅲ組)和紫外線皮膚照射組(Ⅳ組)與對(duì)照組(Ⅴ組)比較均未見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(見(jiàn)表4)。

圖1 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)圖Figure 1 Lymphocytes counting map

組別GroupB淋巴細(xì)胞CD19含量B-Lymphocyte CD19 contentT淋巴細(xì)胞CD3含量T-Lymphocyte CD3 contentCD19/CD3比值CD19/CD3 ratioⅠ組(Ⅰ Group)72±42.5a839±304.8a0.086±0.042aⅡ組(Ⅱ Group)1482±318.1b1874±364.40.824±0.260bⅢ組(Ⅲ Group)1553±1012.31790±503.10.809±0.376Ⅳ組(Ⅳ Group)2103±552.52203±626.31.019±0.338Ⅴ組(Ⅴ Group)2955±1039.12321±687.81.292±0.380

注：與Ⅴ組(空白對(duì)照組)比較,aP<0.01,bP<0.05。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01,bP<0.05.

3 討論

在免疫毒理學(xué)中常見(jiàn)的陽(yáng)性物有地塞米松、氫化可的松、環(huán)磷酰胺等。這些陽(yáng)性物能造成動(dòng)物的免疫抑制。在眾多的相關(guān)文獻(xiàn)中，我們發(fā)現(xiàn)用環(huán)磷酰胺建立免疫力低下的動(dòng)物模型，可以通過(guò)各種方式達(dá)到。鄧少嫦等[13]用劑量100 mg/kg的環(huán)磷酰胺3 d連續(xù)腹腔注射，郭靜等[14]用劑量為50 mg/kg的環(huán)磷酰胺4 d連續(xù)腹腔注射，張芮琪等[15]則用劑量為75 mg/kg的環(huán)磷酰胺隔天分3次腹腔注射，高敏等[16]還用偏最小二乘法(PLS)數(shù)學(xué)建模分析不同劑量環(huán)磷酰胺建立模型的情況，可以看出，以往的研究大多是以腹腔注射為給藥途徑，而為了與試驗(yàn)組給藥途徑一致，本研究建立以灌胃為給藥途徑，連續(xù)3 d 100 mg/kg劑量的環(huán)磷酰胺，也可致KM小鼠免疫力低下模型成立。用本實(shí)驗(yàn)條件下的環(huán)磷酰胺試驗(yàn)組可引起KM小鼠體重明顯下降，小鼠血清免疫球蛋白含量(包括IGG、JGM、IGM)顯著下降，血常規(guī)指標(biāo)白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比等指標(biāo)都出現(xiàn)異常，小鼠外周血B淋巴細(xì)胞CD19、T淋巴細(xì)胞CD3含量顯著下降。由結(jié)果可得，環(huán)磷酰胺具有明顯的免疫抑制作用，選擇其作為保健食品增強(qiáng)免疫力功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)免疫力低下模型建立的陽(yáng)性物是適宜的，動(dòng)物模型在此條件下成立。

本實(shí)驗(yàn)條件下的氫化可的松實(shí)驗(yàn)組制造免疫力低下的動(dòng)物模型某些指標(biāo)沒(méi)有環(huán)磷酰胺實(shí)驗(yàn)組理想，如血清免疫球蛋白IGM含量沒(méi)有顯著性差異、白細(xì)胞和單核細(xì)胞百分比沒(méi)有顯著性差異、外周血T淋巴細(xì)胞濃度亦沒(méi)有顯著性差異。氫化可的松可以建立小鼠免疫力低下的模型國(guó)內(nèi)外很多研究已證明，大多為5次肌肉注射氫化可的松40 mg/(kg·BW)，本實(shí)驗(yàn)條件為經(jīng)口灌胃3 d 80 mg/(kg·BW)氫化可的松，可能在該實(shí)驗(yàn)條件下，沒(méi)有肌注給藥途徑理想，但為了保持和實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象保持相同的給藥途徑，我們還是想優(yōu)先考慮相同途徑，至于經(jīng)口氫化可的松如何能達(dá)到理想的動(dòng)物模型，有待我們進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)條件下60%乙醇溶液組雖然能造成血清免疫球蛋白IGG、IGA、IGM含量顯著性下降，但造成動(dòng)物體重顯著下降，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生了嚴(yán)重的損害，不適宜作為免疫抑制的陽(yáng)性物，至于用15%乙醇溶液灌胃30 d，這是含酒精產(chǎn)品做陰性對(duì)照組的灌胃條件，這樣是否會(huì)造成小鼠免疫力低下，需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)條件下紫外線皮膚照射組沒(méi)有得出的滿意的結(jié)果，估計(jì)是紫外線照射劑量不合適，本實(shí)驗(yàn)照射劑量是參考豚鼠皮膚光毒實(shí)驗(yàn)劑量，在此劑量下豚鼠可以造成皮膚傷害，可能是豚鼠和小鼠存在種間差異的緣故。王麗英等提出紫外線對(duì)免疫系統(tǒng)的影響可能有雙重作用[17-22]，亦有可能誘發(fā)機(jī)體免疫抑制，又有可能誘導(dǎo)機(jī)體免疫保護(hù)，并對(duì)此種差異的產(chǎn)生列舉了4種不同因素有關(guān)，故紫外線對(duì)免疫系統(tǒng)的影響在學(xué)術(shù)界依然存在著很大的爭(zhēng)議。

因此，連續(xù)經(jīng)口灌胃環(huán)磷酰胺(100 mg/kg)3 d，建立的KM小鼠免疫力低下的動(dòng)物模型是成立的，是本實(shí)驗(yàn)室首選條件。這一實(shí)驗(yàn)條件的建立和實(shí)驗(yàn)證明是建立免疫力低下小鼠動(dòng)物模型的創(chuàng)新，在其他文獻(xiàn)資料中鮮見(jiàn)。

如何檢測(cè)免疫抑制動(dòng)物模型成立，方法有很多，常見(jiàn)的有：臟器指數(shù)，血常規(guī)及生化指標(biāo)，血清免疫球蛋白含量，NK活性細(xì)胞測(cè)定，碳廓清實(shí)驗(yàn)，抗體生成細(xì)胞檢測(cè)，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)等等，從各種檢測(cè)指標(biāo)簡(jiǎn)便容易程度上來(lái)看，體重、血清免疫球蛋白含量、血常規(guī)這三個(gè)指標(biāo)簡(jiǎn)單易得，檢測(cè)成本低廉且時(shí)間周期短，檢出有效率高。而外周血B淋巴細(xì)胞CD19、T淋巴細(xì)胞CD3含量的檢測(cè)費(fèi)用高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，但測(cè)出的數(shù)值可靠性強(qiáng)[23-25]。本次研究這四種指標(biāo)都相互驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，作為日常檢測(cè)工作的動(dòng)物模型建立確認(rèn)的指標(biāo)，本研究推薦動(dòng)物體重、血清免疫球蛋白含量、血常規(guī)三項(xiàng)易得的指標(biāo)。推薦的這三項(xiàng)指標(biāo)，亦是本研究大膽開(kāi)創(chuàng)性的嘗試，期望在以后更多的實(shí)踐工作中同行能用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與改進(jìn)。