基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢測實驗動物病原菌效果初探

邢 進，劉 娜，馮育芳，張雪青，崔生輝，賀爭鳴，趙德明，岳秉飛*

(1.中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所，北京 102629； 2.中國食品藥品檢定研究院 食品化妝品檢定所，北京 100050； 3.中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

根據我國實驗動物微生物檢測國家標準，病原菌的檢測一直依賴于分離培養和血清學鑒定，不僅需要檢測人員具有較豐富的經驗，效率和準確性方面都亟待改進。因此分子生物學方法，比如PCR、熒光定量PCR等已逐漸應用到實驗動物病原菌檢測當中。然而進行病原菌的PCR檢測，但是需要對實驗室實行嚴格的分區和污染控制?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)依靠激發微生物生成的蛋白質譜與專有數據庫進行比較，以實現對微生物的鑒定。其具有操作簡單、高效、準確等諸多優勢，已經成為微生物鑒定的一種快速而可靠的工具[1]。目前國內外應用MALDI-TOF MS方法鑒定微生物效果的研究已廣泛開展，其中與實驗動物相關的病原菌主要有金黃色葡萄球菌[2-3]、肺炎鏈球菌[4]、乙型溶血性鏈球菌[5]、綠膿桿菌[6]、志賀菌[7]、小腸結腸炎耶爾森氏菌[8]、棒狀桿菌[9-10]、巴斯德桿菌[11-12]、皮膚真菌[13]等。然而尚缺乏針對實驗動物病原菌整體鑒定效果的研究，本研究采用德國布魯克公司的Biotyper微生物質譜檢測系統對相關菌株進行鑒定，初步評價MALDI-TOF MS方法對實驗動物病原菌的檢測效果。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標準菌株

40株標準菌株，購自美國標準物質保藏中心(ATCC)、中國醫學菌種保藏中心(CMCC)和中國獸醫微生物菌種保藏管理中心(CVCC)。見表1。

1.1.2 分離菌株

384株實驗動物分離菌株包括沙門氏菌4株、金黃色葡萄球菌21株、綠膿桿菌32株、嗜肺巴斯德桿菌315株、多殺巴斯德桿菌2、肺炎鏈球菌1株、肺炎克雷伯桿菌3株、產酸克雷伯桿菌1株、志賀菌1株、牛棒狀桿菌2株、辛氏鮑特桿菌1株和嗜水氣單胞菌1株。其中金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、牛棒狀桿菌、綠膿桿菌和辛氏鮑特桿菌各有1株國際實驗動物科學理事會(ICLAS)國際比對菌株。

1.2 主要試劑與儀器

哥倫比亞血瓊脂培養基(Oxiod，CM0331)，脫纖維羊血(北京路橋)，厭氧袋和厭氧盒(三菱MGC AnaeroPack)，Nuclease-Free Water(Promaga，P1193)，PCR反應試劑(TAKARA，R010 A)，細菌生化鑒定板(BD phoenix，448505，448008)，甲酸(J&K，299272)，基質溶液(Bruker IVD HCCA，8255344)。16Sr DNA擴增引物FD1∶5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，RP2∶5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’[14](上海生工)。布魯克微生物快速鑒定系統(Bruker MALDI Biotyper IVD)、A2級生物安全柜(NUAIR-NU-437-400S)、核酸提取儀(Qiagen QIAcubeHT)、超微量紫外分光光度計(Implen NanoPhotometer)、恒溫培養箱(Thermo IGS180)、全自動細菌鑒定儀(BD phoenix100)、PCR儀(ABI Veriti96)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的培養

所有受試菌株接種于5%哥倫比亞血瓊脂培養基，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、志賀菌、克雷伯桿菌和嚙齒類檸檬酸桿菌置36℃培養24 h；巴斯德桿菌、鏈球菌、棒狀桿菌、支氣管鮑特桿菌和念珠狀鏈桿菌置36℃培養48 h；耶爾森菌和嗜水氣單胞菌至27℃分別培養48 h和24 h；空腸彎曲菌36℃厭氧培養48 h。初代培養物按相同條件傳代一次，次代菌落用于生化、測序和MALDI-TOF MS鑒定。

1.3.2 菌株的驗證

對所有受試的標準菌株和分離菌株使用BD phoenix 100進行生化鑒定，同時提取基因組DNA，用引物FD1/RP2擴增16S rDNA，產物經測序后經Genbank BLAST比對，驗證所用菌株的準確性。

1.3.3 MALDI-TOF MS鑒定

根據布魯克微生物快速鑒定系統操作規程，采用直接轉移法制備待檢樣本。用一次性接種環挑取受試菌株單個菌落，直接涂抹于不銹鋼MALDI MSP靶板圓孔中，每孔滴加70%甲酸溶液1 μL，室溫下晾干。隨后用2 μL基質溶液覆蓋，自然晾干后上機鑒定。結果用Biotyper 3.0 database處理分析。

2 結果

2.1 受試菌株驗證

40株標準菌株和384株分離菌株經生化和16S rDNA序列比對驗證，所有菌株確定無誤。

2.2 MALDI-TOF MS分析

2.2.1 標準菌株鑒定結果

標準菌株的質譜結果分值區間為1.532～2.546，鑒定正確率為90.0%(36/40)。對所有沙門氏菌只能鑒定到屬水平，不能確定到種。其中鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115被鑒定為嚙齒類枸櫞酸桿菌；假結核耶爾森氏菌CMCC53521被鑒定為小腸結腸炎耶爾森氏菌；志賀菌所有菌株全部有誤，結果為埃希氏菌或Kosakonia；嗜肺巴斯德桿菌Heyl型被鑒定為艱難梭菌；支氣管鮑特桿菌被鑒定為百日咳鮑特桿菌。

2.2.2 分離株鑒定結果

MALDI-TOF MS對實驗動物病原菌分離株鑒定的準確率為80.0%(307/384)。沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴斯德桿菌、肺炎鏈球菌等幾種常規實驗動物病原菌鑒定結果全部準確；不在國家標準中的牛棒狀桿菌、辛氏鮑特桿菌和產酸克雷伯桿菌項目也都準確鑒定。1株實驗用魚需檢測的嗜水氣單胞菌鑒定準確(結果見表2)。

3株肺炎克雷伯桿菌分離株1株鑒定正確，1株鑒定為產酸克雷伯桿菌，另1株鑒定為新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)；志賀菌分離株為福氏志賀菌，與標準菌株類似，被鑒定為大腸桿菌。315株嗜肺巴斯德桿菌分離株的鑒定結果準確率為76.5%(241/315)，具體鑒定結果見表3。利用這些分離菌株，重新構建了嗜肺巴斯德桿菌質譜數據庫，提高了鑒定的準確率。

表1 標準菌種質譜結果

注：a：2.300～3.000極可能的菌種鑒定；2.000～2.299可靠的菌屬鑒定，可能的菌種鑒定；1.700～1.999可能的菌屬鑒定；0.000～1.699不可靠的鑒定。

Note. a, Identification of 2.300～3.000 highly probable species. 2.000～2.299 secure genus and probable species. 1.700～1.999 probable genus. 0.000～1.699 unreliable identification.

表2 分離株鑒定結果匯總

表3 嗜肺巴斯德桿菌鑒定結果

注：a： ATCC12555；b： ATCC 35149；c： 北京流行株。圖1 嗜肺巴斯德桿菌ATCC12555、ATCC35149和北京流行株質譜峰圖Note. a， ATCC12555. b， ATCC 35149. c， Beijing epidemic strains.Figure 1 MALDI-TOF MS spectrum of Pasteurella pneumophila ATCC12555,ATCC35149 and Beijing epidemic strains

3 討論

本次研究所用菌株包括了大部分實驗動物常見的可培養病原菌，還特別列入了幾株國際實驗動物科學理事會(ICLAS)檢測目錄中的細菌，用以評價質譜方法檢測這些病原菌的效果。實驗動物宿主涉及常規嚙齒類、兔、雞、魚、犬、猴、豬等。

微生物質譜鑒定系統結果的可靠性依賴于相關菌株的基礎數據庫[15]。本次研究中，鼠傷寒沙門氏菌、志賀菌、假結核耶爾森氏菌、肺炎克雷伯桿菌、支氣管鮑特桿菌和嗜肺巴斯德桿菌的標準菌株鑒定出現錯誤。特別是對志賀菌的鑒定全部有誤，錯誤結果主要為與大腸桿菌的混淆，與報道一致[7]，需要補充數據庫才能加以區分。

本研究中使用了315株嗜肺巴斯德桿菌分離株，主要分離自北京地區的實驗動物。嗜肺巴斯德桿菌在實驗動物中感染率高，尚缺乏針對性的質譜鑒定研究。本結果顯示，Bruker Biotyper系統及其原有數據庫對嗜肺巴斯德桿菌鑒定準確率尚可，大部分菌株可鑒定到種，錯誤結果可鑒定到科水平。最新分類研究已將嗜肺巴斯德桿菌的Jawetz和Heyl生物型重新分類并命名為Rodentibacterpneumotropicus和Rodentibacterheylii[16]兩種菌。通過分析二者質譜峰圖(見圖1)，可見Heyl型與Jawetz型存在明顯差異，前者在3900 m/z和7800 m/z兩處的峰明顯高于后者。北京地區流行株應屬于Heyl型，其質譜峰圖與Heyl型更為相近，與生化結果、PCR方法，以及分子分型[17]的鑒定結果相符。通過重新自定義數據庫，即可快速區分嗜肺巴斯德桿菌Jawetz和Heyl生物型，即區分R.pneumotropicus和R.heylii，為二者的鑒別檢測提供依據。鑒于伯杰細菌鑒定手冊暫未改版，各種自動細菌鑒定系統對嗜肺巴斯德桿菌的分類也未做修改，檢測結果仍定義為嗜肺巴斯德桿菌。

質譜檢測方法與自動生化鑒定系統、PCR方法相比具有不可比擬的優勢，不同品牌的質譜系統數據分析和統計方法各不相同，但都需要依靠龐大的專有數據庫才能確保鑒定的準確性。因此對于實驗動物病原菌的鑒定，還需在檢測中不斷收集更多的菌株補充和完善數據庫。目前國產微生物鑒定質譜儀與進口品牌鑒定效果已無明顯差距[15]，相信隨著本土菌株數據庫不斷豐富和完善，質譜檢測將會逐步普及，并成為實驗動物病原菌檢測的重要手段。