miR-221靶向AdipoR1基因對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549炎癥分泌及凋亡影響

亓水芹 馮向功

(鄭州澍青醫學高等專科學校病原生物與免疫學教研室，鄭州 450064)

急性肺損傷是肺內外各種因素導致的急性炎癥性肺損傷，可進展為急性呼吸窘迫綜合征，病死率高達50%～70%[1]。肺泡上皮細胞損傷是急性肺損傷的主要病理特征之一，因此研究肺泡上皮細胞損傷分子機制對治療急性肺損傷具有重要意義[2,3]。

MicroRNA(miRNA)是真核生物中高度保守的一類非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的3′UTR區互補結合抑制基因轉錄后翻譯以調節基因表達，參與急性肺損傷后炎癥反應、細胞凋亡及肺泡液體清除等整個病理過程[4,5]。miR-221是一種具有類似癌基因功能的miRNA，近年來研究報道，miR-221與細胞炎癥因子分泌也有關[6,7]。脂聯素是脂肪細胞分泌的一種細胞因子，通過與脂聯素受體(adiponectin receptor，AdipoR)結合參與抵抗炎癥反應、調節葡萄糖和脂肪酸代謝等生命過程[8]。目前，miR-221和AdipoR1在急性肺損傷中的作用尚未見報道。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁中的重要成分，可誘導宿主細胞炎性反應繼而造成免疫功能障礙。國內外研究表明，氣管內滴注LPS可造成大鼠急性肺損傷[9,10]。因此本研究采用LPS體外干預人肺泡上皮細胞A549，模擬肺損傷，研究miR-221和AdipoR1對肺泡上皮細胞炎癥因子分泌和凋亡的影響，并初步探討其潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人肺泡上皮細胞A549由中國科學院上海細胞庫提供；LPS(Sigma公司)；高糖DMEM培養基和胎牛血清(Gibco公司)；Trizol試劑和RIPA裂解液(Invitrogen公司)；Lipofectamine 2000轉染試劑、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)；酶聯免疫吸附法(ELISA)IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；AdipoR1抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和β-antin抗體Ⅰ抗及相應Ⅱ抗購自武漢博士德生物工程有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；miR-221模擬物(miR-221 mimics)及無義序列模擬物(mimics control)、miR-221抑制物(miR-221 inhibitor)及無義序列抑制物(inhibitor control)、AdipoR1小干擾RNA(siRNA-AdipoR1)及siRNA無義序列(siRNA control)由廣州市銳博生物科技有限公司設計并合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養、分組 將人肺泡上皮細胞A549接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，放于37℃，5%CO2培養箱中培養，當細胞培養至80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養。

將細胞隨機分組：對照組(NC組，為正常培養細胞)；LPS組(取對數生長期的細胞，加入濃度為10 μg/ml的LPS處理24 h)；LPS+轉染組[取生長密度達50%～60%的細胞，使用Lipofectamine 2000轉染試劑將inhibitor control(anti-miR-con)、miR-221-inhibitor(anti-miR-221)、mimics control(miR-con)、miR-221-mimics(miR-221)、siRNA control(si-con)、siRNA-AdipoR1(si-AdipoR1)、pcDNA3.1空載體、pcDNA3.1-AdipoR1(pcDNA-AdipoR1)分別轉染至細胞，轉染培養24 h后，加入LPS處理24 h]。實驗中LPS處理濃度參考施榮等[11]方法。

1.2.2細胞中miR-221和AdipoR1 mRNA檢測 采用RT-qPCR法檢測細胞中miR-221和AdipoR1 mRNA表達。使用Trizol試劑抽提處理后各組細胞總RNA，紫外分光光度計下檢測RNA樣品的純度和濃度，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整性。按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄反應，合成cDNA，以cDNA為模板進行qPCR反應。miR-21上游引物序列5′-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′，下游引物序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；AdipoR1上游引物序列5′-GGCTGAAAGACAATGACTAC-3′，下游引物序列5′-TCAAGATTCCCAGAAAGAG-3′；U6上游引物序列5′-GCGCGTCGTTAAGCGTTC-3′，下游引物序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；β-antin上游引物序列5′-TCACCCACACTGTGCCCCATCTACGA-3′，下游引物序列5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。結果分別以U6和β-antin為內參基因，采用2-ΔΔCT法計算miR-221和AdipoR1 mRNA相對表達水平。

1.2.3細胞中AdipoR1蛋白和凋亡相關蛋白檢測 蛋白檢測采用Western blot法。使用含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液提取處理后各組細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白樣品濃度并定量，取50 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，濕轉法轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)上。室溫下5%脫脂奶粉封膜1 h，分別加入稀釋后的AdipoR1抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和β-antin抗體Ⅰ抗，4℃孵育過夜，洗膜，然后加入稀釋后的相應Ⅱ抗，室溫孵育2 h。洗膜，加入ECL發光液中顯色10 min，Odyssey紅外激光成像系統下曝光，拍照，應用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶灰度值并計算目的蛋白相對表達水平。

1.2.4細胞凋亡檢測 采用雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡率。收集處理后的各組細胞，重懸細胞并調整細胞密度為2×106個/ml，取1 ml細胞重懸液加入流式管中，離心后棄上清，使用PBS溶液洗滌2次。1×Binding Buffer重懸細胞后，分別加入5 μl Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光反應15 min，流式細胞儀檢測細胞情況并計算細胞凋亡率。

1.2.5細胞上清液中炎性因子檢測 收集各組細胞培養上清液，采用ELISA法檢測上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度，檢測方法嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗 為證實miR-221是否靶向AdipoR1，本研究將AdipoR1的3′UTR區(CGCCCACCATGCACTTTACTAT)構建質粒載體，分別于miR-con、miR-221-mimics共轉染正常培養的細胞，常規培養48 h后，收集培養上清液，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1miR-221和AdipoR1在LPS誘導的肺泡上皮細胞A549中的表達 與對照組比較，LPS組肺泡上皮細胞中miR-221相對表達水平上調(P<0.05，圖1A)，AdipoR1 mRNA和蛋白相對表達水平下調(P<0.05，圖1B、C和D)。

2.2抑制miR-221對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549中炎癥因子分泌的影響 與對照組比較，LPS組肺泡上皮細胞培養上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯升高(P<0.05)；與LPS+anti-miR-con組比較，LPS+anti-miR-221組細胞培養上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯降低(P<0.05)。見圖2。

2.3抑制miR-221對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549凋亡的影響 與對照組比較，LPS組肺泡上皮細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，細胞中Bax蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與LPS+anti-miR-con組比較，LPS+anti-miR-221組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，細胞中Bax蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖3。

圖1 LPS誘導肺泡上皮細胞A549中miR-221和Adipo-R1表達變化Fig.1 Expression of miR-221 and AdipoR1 in alveo-lar epithelial cells A549 was induced by LPSNote:A，B.The expressions of miR-221 and AdipoR1 mRNA were detected by qPCR；C，D.The protein expression of AdipoR1 was detected by Western blot.Compared with NC group,*.P

2.4miR-221靶向AdipoR1 生物信息學軟件分析顯示(圖4A)，miR-221能夠與AdipoR1的3′UTR區結合。雙熒光素酶報告實驗結果(圖4B)，過表達miR-221明顯抑制AdipoR1的轉錄活性，而將AdipoR1的3′UTR區突變后抑制作用消失。

Western blot實驗結果(圖4C)，過表達miR-221后細胞中AdipoR1蛋白表達明顯降低(P<0.05)，而

圖2 ELISA檢測細胞培養上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平Fig.2 Expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in cell culture supernatants by ELISANote:Compared with NC group,*.P P

圖3 干擾miR-221對LPS誘導肺泡上皮細胞A549凋亡的影響Fig.3 Effect of interference with mir-221 on apoptosis of alveolar epithelial cells A549 induced by LPSNote:A，B.Apoptosis of alveolar epithelial cells A549 was detected by flow cytometry；C，D.The expressions of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2 were detected by Western blot.Compared with NC group,*.P P

圖4 miR-221靶向調控AdipoR1的表達Fig.4 miR-221 targets and regulates expression of AdipoR1Note:A.miR-221 complements the 3′UTR of AdipoR1; B.Luciferase activity was detected; C.Effect of miR-221 expression on AdipoR1 protein expression.Compared with miR-con group,*.P P

圖5 沉默AdipoR1對LPS誘導肺泡上皮細胞A549炎癥因子水平和細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of silenced AdipoR1 on inflammatory factor level and apoptosis of alveolar epithelial cells A549 induced by LPSNote:A.The expression levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in cell culture supernatant were detected by ELISA; B.Apoptosis of alveolar epithelial cells A549 was detected by flow cytometry; C，D.The protein expressions of AdipoR1, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot.Compared with NC group,*.P P

圖6 過表達AdipoR1和轉染anti-miR-221對LPS誘導肺泡上皮細胞A549炎癥因子和細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of over-expression of AdipoR1 and transf-ection of anti-miR-221 on inflammatory factors and apoptosis of A549 alveolar epithelial cells induced by LPSNote:A.The expression levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in cell culture supernatant were detected by ELISA; B.Apoptosis of alveolar epithelial cells A549 was detected by flow cytometry; C，D.The protein expressions of AdipoR1, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot.Compared with LPS+anti-miR-con group,*.P P

抑制miR-221表達后細胞中AdipoR1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。

2.5過表達AdipoR1對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549炎癥因子和細胞凋亡的影響 與LPS+pcDNA組比較，LPS+pcDNA-AdipoR1組細胞中AdipoR蛋白表達明顯升高(P<0.05)，細胞培養上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯降低(P<0.05)，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，細胞中Bax蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖5。

2.6抑制miR-221和干擾AdipoR1對LPS誘導的肺泡上皮細胞A549炎癥因子和細胞凋亡的影響 與LPS+anti-miR-221+si-con組比較，LPS+anti-miR-221+si-AdipoR1組細胞中AdipoR1蛋白表達降低(P<0.05)，細胞培養上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度升高(P<0.05)，細胞凋亡率升高(P<0.05)，細胞中Bax蛋白表達升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)。見圖6。

3 討論

miRNA異常改變與炎癥信號通路、免疫反應、細胞生理等生物過程密切相關，因此miRNA在人類疾病的靶向治療中具有潛在的應用前景。Knyazev等[12]報道，miR-221在TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞炎癥反應中表達上調，通過作用于靶基因調控細胞周期和炎癥反應狀態等。Peng等[13]報道，miR-221肥胖脂肪組織中過表達通過靶向抑制SIRT1蛋白表達，引起炎癥和胰島素抵抗，而抑制miR-221則改善炎癥和胰島素敏感性。提示miR-221可能具有促炎作用。本研究結果，LPS誘導肺泡上皮細胞中miR-221表達上調，細胞分泌炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高；而抑制miR-221后，LPS誘導的細胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌明顯減少，說明靶向miR-221能夠有效抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞炎癥反應。臨床研究表明，在急性肺損傷發生的不同時期均有細胞凋亡現象，細胞過度凋亡將會加重急性肺損傷的病理變化[14,15]。本研究發現，LPS誘導肺泡上皮細胞凋亡率明顯升高，而抑制miR-221后有效抑制LPS誘導的細胞凋亡。說明靶向miR-221能夠緩解LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷，可能對急性肺損傷有改善作用。

目前，脂聯素在肺病理中的作用尚存在爭議。Chen等[16]報道，脂聯素通過AdipoR1/2依賴性刺激細胞溶質磷脂酶A2(cPLA2)和環加氧酶2(COX-2)表達及細胞內活性氧產生，促進過敏原或臭氧誘導的肺部炎癥反應。而Nigro等[17]報道，脂聯素以劑量和時間依賴性的方式降低TNF-α和IL-1β對人肺泡上皮細胞A549的毒性作用，從而改善細胞活力并減少細胞凋亡，并通過AdipoR1介導抑制NF-κB轉錄激活而誘導抗炎細胞因子表達。本研究結果，LPS誘導后，肺泡上皮細胞中AdipoR1表達降低，而過表達AdipoR1后明顯抑制LPS誘導的細胞凋亡和炎癥反應。可能因為過表達AdipoR1有助于脂聯素作用發揮，在LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷中起到抗炎、抗凋亡作用，其作用與Nigro等研究結果相似。

Liu等[18]報道，miR-6835在LPS誘導的人臍靜脈內皮細胞炎癥過程中起促進作用，其機制與直接靶向抑制AdipoR1的表達，并調節其下游信號蛋白表達有關。提示靶向干預AdipoR1的表達可能對LPS誘導的細胞炎癥反應有改善作用。本研究通過生物信息學軟件分析和相關實驗證實AdipoR1是miR-221的靶基因，進一步分析發現同時抑制miR-221和AdipoR1基因的肺泡上皮細胞，經LPS處理后，細胞培養上清液中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度升高，凋亡蛋白Bax表達增多，Bcl-2蛋白表達降低，細胞凋亡率升高，說明抑制AdipoR1基因后，抑制miR-221對LPS誘導的肺泡上皮細胞炎癥反應和凋亡的抑制作用消失。因此推測miR-221對LPS誘導的肺泡上皮細胞炎癥反應和凋亡的影響是通過靶向AdipoR1基因實現的。

綜上所述，LPS誘導的肺泡上皮細胞中miR-221表達上調，AdipoR1表達下調，miR-221可以靶向調控AdipoR1的表達影響LPS誘導的肺泡上皮細胞炎癥反應和凋亡，提示miR-221和AdipoR1可能參與LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷，有望成為急性肺損傷診斷及治療的潛在靶點。