黃芩素通過失活JAK/STAT信號通路抑制T24細胞遷移侵襲①

于汝通 孫國良 張 劍 陳志強 蔣 泉

(承德市中心醫院泌尿外科，承德 067000)

膀胱癌發生在膀胱黏膜的惡性腫瘤，居泌尿男性生殖系統腫瘤之首。膀胱癌在歐洲許多國家的發病率呈上升趨勢，其在菲律賓、冰島膀胱癌的死亡數大幅度下降，死亡率卻上升[1]。膀胱癌在我國的發病率和死亡率均呈上升趨勢。吸煙、飲酒及有毒物質的職業暴露是膀胱癌發生的誘因，尤其是中國男性人群吸煙、飲酒率較高，極易發生膀胱癌[2]。膀胱癌的治療方法有很多，手術治療及后期的化療均對患者造成后遺癥，預后也不夠理想。中藥具有悠久的歷史，在抗腫瘤治療中具有毒副作用小、取材廣的優點，其在膀胱癌的治療中已成為不可或缺的藥物，對西藥療法具有揚長補短的作用[3]。中藥鴉膽子、夏枯草、豬苓、黃芩等對膀胱癌均具有治療作用。早在2000年日本學者Ikemoto等[4]報道，黃芩具有抗膀胱癌作用。黃芩素(Baicalein,BAI)是從黃芩的干燥根中提取的主要有效成分，也是黃芩發揮藥理作用的基礎[5]。近年來，大量體內外實驗均證實黃芩素具有較強的抗腫瘤活性，單用黃芩素或與其他中醫藥聯用均可抑制腫瘤的發生、生長及轉移，對乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肝細胞性肝癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤均有一定預防及治療作用[6,7]。但黃芩素在膀胱癌中的作用機制尚未完全清楚。侵襲與轉移是惡性腫瘤本質的特性之一，也是導致腫瘤患者死亡的主要原因。Janus 蛋白酪氨酸激酶(Janus protein tyrosine kinase,JAK)/信號轉導和轉錄活化蛋白(signal transducer and activator oftranscription,STAT)是一條極其迅速地細胞外到細胞核的信號轉導通路[8]。近年來發現，JAK/STAT 激活，特別是 STAT3 的激活對腫瘤的發生、發展有著重要影響[9]。但JAK/STAT信號通路對膀胱癌的作用機制尚未完全明白。本研究將通過觀察黃芩素和JAK/STAT通路對膀胱癌細胞侵襲、遷移的影響，揭示黃芩素抑制膀胱癌細胞侵襲、遷移，可能與失活JAK/STAT通路有關，將為膀胱癌的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 人膀胱癌細胞T24購自美國ATCC；黃芩素購于成都MUST公司；組織基質金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)、組織基質金屬蛋白酶抑制劑2(TIMP-2)、McCoy′s 5a Medium培養基購自上海研生公司；BCA蛋白定量試劑盒、脂質體LipofectamineTM2000、逆轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；PVDF膜購自德國羅氏診斷有限公司；SDS-PAGE 試劑盒、Transwell小室、基質膠、ECL發光液和RIPA蛋白裂解液、RPMI1640培養基、胎牛血清均購自美國Sigma公司；凝膠成像分析儀購自柯達公司；半干轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自美國 FALS CALIBAR BD公司；ABI 7500型實時熒光定量PCR系統購自美國ABI公司；紫外分光光度計購自美國Thermo公司；細胞培養箱購自美國Forma Scientific公司

1.2方法

1.2.1細胞培養 用含10%胎牛血清的McCoy′s 5a Medium培養基培養人膀胱癌細胞T24，置于37℃，5%CO2的培養箱中常規培養。將黃芩素(5、10、25、50 μmol/L)與T24細胞共培養48 h，分別標記為5 μmol/L BAI組、10 μmol/L BAI組、25 μmol/L BAI組、50 μmol/L BAI組，用于Transwell實驗、Western blot實驗。

1.2.2Transwell遷移實驗 取適量對數生長期1.2.1各組細胞，調整細胞密度為105個/ml。取100 μl加入上室內，600 μl含血清的培養基加入下室內，細胞常規培養過夜。取出小室，用棉簽擦去上室內的細胞，PBS洗滌2次，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌2次。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細胞，隨機取3個視野拍照計數，取平均數。

1.2.3Transwell侵襲實驗 取適量對數生長期1.2.1各組細胞，調整細胞密度為105個/ml。在小室上表面涂抹適量厚度的基質膠后，取100 μl加入上室內，600 μl含血清的培養基加入下室內，細胞常規培養過夜。取出小室，用棉簽擦去上室內的細胞，PBS洗滌2次，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌2次。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細胞，隨機取3個視野拍照計數，取平均數。

1.2.4Western blot實驗 RIPA蛋白裂解液對研磨組織或對數期細胞進行冰上蛋白裂解1 h，提取總蛋白，以BCA法測定樣品蛋白的濃度。以4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液(×5)，混勻，沸水浴變性5 min，離心取上清，取60 μg目的蛋白、蛋白Marker進行SDS-PAGE蛋白電泳。然后將蛋白濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌，4℃條件下，將封閉后的PVDF膜放入1∶1 000倍稀釋的一抗中反應過夜，以封閉液洗膜3次，每次5 min，在37℃下將PVDF膜轉入1∶2 000倍稀釋的二抗中反應2 h。于暗室內ECL試劑盒顯影曝光：滴加化學發光劑顯影，以凝膠成像系統采集圖像。Image J分析目的條帶的灰度值，以GAPDH為內參，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達情況。

2 結果

2.1黃芩素抑制膀胱癌細胞遷移 將黃芩素(5、10、25、50 μmol/L)處理48 h的T24細胞，用Tanswell檢測細胞遷移，如圖1所示，黃芩素處理組與NC組相比，細胞遷移量均顯著降低，且呈濃度依賴性。

2.2黃芩素抑制膀胱癌侵襲 將黃芩素(5、10、25、50 μmol/L)處理48 h的T24細胞，用Tanswell檢測細胞侵襲， 如圖2所示，黃芩素處理組與NC組相比，細胞侵襲量均顯著降低，且呈濃度依賴性。

圖1 不同濃度黃芩素對膀胱癌細胞遷移的影響Fig.1 Effect of different concentrations of baicalein on migration of bladder cancer cellsNote: *.P P

2.3黃芩素對遷移、侵襲相關蛋白的影響 將50 μmol/L 黃芩素處理的T24細胞，用Western blot檢測uPA、MMP-9、TIMP-1和 TIMP-2的蛋白表達，50 μmol/L BAI組于NC組，uPA、MMP-9蛋白表達顯著降低，TIMP-1、 TIMP-2蛋白表達顯著升高(圖3A、B)，均具有統計學意義(P<0.05)。

2.4黃芩素失活JAK/STAT信號通路 50 μmol/L BAI組于NC組，p-JAK2蛋白表達顯著降低，p-STAT蛋白表達顯著降低(圖4A、B)，均具有統計學意義(P<0.05)?？梢?，黃芩素失活JAK/STAT信號通路。

圖2 不同濃度黃芩素對膀胱癌細胞侵襲的影響Fig.2 Effect of different concentrations of baicalein on invasion of bladder cancer cellsNote: *.P P

圖3 黃芩素對膀胱癌細胞遷移、侵襲相關蛋白的影響Fig.3 Effect of baicalein on migration and invasion-related proteins in bladder cancer cellsNote: *.P P

圖4 黃芩素對JAK/STAT通路相關蛋白表達的影響Fig.4 Effect of baicalein on expression of JAK/STAT pathway-related proteinsNote: **.P

2.5JAK/STAT信號通路對膀胱癌細胞遷移、侵襲的影響 將JAK/STAT 信號通路激活劑IL-6，50 ng/ml處理T24細胞，標記為IL-6組，JAK/STAT信號通路抑制劑AG490，50 μmol/L處理T24細胞，標記為AG490組，未做任何處理的T24細胞標記為NC組。IL-6組NC組，細胞遷移量顯著升高，AG490組相比NC組，細胞遷移量顯著降低(圖5A)；IL-6組于NC組，細胞侵襲量顯著升高，AG490組于NC組，細胞侵襲量顯著降低(圖5B)，均具有統計學意義(P<0.05)?？梢?，JAK/STAT 信號通路的活性與膀胱癌細胞的細胞遷移、侵襲量呈正相關。

圖5 JAK/STAT通路對膀胱癌細胞侵襲和遷移的影響Fig.5 Effect of JAK/STAT pathway on invasion and migration of bladder cancer cellsNote: A.Effect of JAK/STAT signaling pathway on cell migration of T24 cells;B.Effect of JAK/STAT signaling pathway on cell invasion of T24 cells.*.P

圖6 JAK/STAT信號通路激活劑逆轉了黃芩素對制膀胱癌細胞的遷移、侵襲的作用Fig.6 Baicalin inactivated JAK/STAT signaling pathway inhibits migration and invasion of bladder cancer cellsNote: A.Effect of baicalein and JAK/STAT signaling pathway on T24 cell migration;B.Effect of baicalein and JAK/STAT signaling pathway on T24 cell invasion.*.P P

2.6JAK/STAT信號通路激活劑逆轉了黃芩素對膀胱癌細胞的遷移、侵襲作用 BAI組相比于NC組，細胞遷移量顯著降低，BAI+IL-6組于BAI+Vehicle組，細胞遷移量顯著升高(圖6A)；BAI組于NC組，細胞侵襲量顯著降低，BAI+IL-6組于BAI+Vehicle組，細胞侵襲量顯著升高(圖6B)，均具有統計學意義(P<0.05)。可見，黃芩素可失活JAK/STAT信號通路抑制膀胱癌細胞的遷移、侵襲。

3 討論

癌癥是全球人類死亡的主要原因之一，也是全球主要的健康問題。近幾十年來，由于各種原因，癌癥的死亡率和發病率都迅速增加。盡管有治療選擇，但化療藥物和多種形式的耐藥性均會產生嚴重的副作用，從而顯著的降低其療效。大量研究已證實黃芩素的藥理活性(抗炎、抗氧化、抗病毒和抗腫瘤)[10]。黃芩又稱土金茶根、山茶根，為唇形科植物，據《神農本草經》記載“用于諸熱黃膽，腸泄痢，惡瘡疽蝕火瘍”。現黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效。黃芩素是黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一。黃芩素的化學名稱是5,6,7-三羥基黃酮，黃芩苷由一分子的葡萄糖醛酸結合而成的苷類化合物[11]。黃芩素的抗腫瘤功能主要是由其抑制細胞周期蛋白復合物調節細胞周期、清除氧化自由基、減弱絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶B(Akt)、激活caspase-9/caspase-3誘導細胞凋亡，或通過調控基質金屬蛋白酶(MMP-2/MMP-9)的表達以抑制腫瘤細胞遷移、侵襲。尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)是一種絲氨酸蛋白水解酶，其在多種腫瘤中過表達，發揮浸潤轉移作用[12]。黃芩素在多種癌癥中的治療作用已被證實。據Choi等[13]研究報道，黃芩素可通過激活ROS依賴的半胱天冬酶誘導人膀胱癌細胞5637凋亡。Chao等[14]報道在膀胱癌細胞中黃芩素較黃芩苷、兒茶素、槲皮素、蘆丁能更好地抑制細胞增殖，促進凋亡，且黃芩素可能通過失活CDC2-Survivin途徑以利于膀胱癌細胞的凋亡，抑制增殖。

本研究運用Transwell法檢測了黃芩素處理的T24細胞發現，黃芩素可抑制T24細胞的細胞遷移、侵襲；進一步運用Western blot檢測細胞中uPA、MMP-9、TIMP-1和 TIMP-2的蛋白表達發現，黃芩素可下調uPA、MMP-9的表達，上調TIMP-1、 TIMP-2的表達，提示黃芩素抑制膀胱癌細胞遷移、侵襲，可能與下調uPA、MMP-9的表達，上調TIMP-1、 TIMP-2有關。

JAK/STAT信號通路在腫瘤中的研究備受矚目，該通路與單鏈蛋白家族、gp 130家族、干擾素家族及G蛋白偶聯受體的信號轉導途徑均有聯系[15]。李冠軍等[16]在膀胱癌的研究中運用Western blot實驗檢測過表達miR-153對JAK/STAT信號通路的影響發現，過表達miR-153可下調p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達，又用Transwell法檢測了過表達miR-153對膀胱癌細胞遷移、侵襲能力的影響，揭示miR-153可通過失活JAK/STAT信號通路抑制膀胱癌細胞的遷移侵襲。本研究通過JAK/STAT信號通路特異性抑制劑和JAK/STAT信號通路特異性激活劑與T24細胞共培養，用Transwell法檢測細胞的遷移、侵襲，發現激活JAK/STAT信號通路可促進膀胱癌細胞遷移、侵襲，失活，JAK/STAT信號通路可抑制膀胱癌細胞遷移、侵襲，揭示JAK/STAT信號通路的活性與膀胱癌細胞遷移、侵襲能力成正相關。

JAK/STAT是一條重要的信號通路,可介導多種細胞因子和生長因子的細胞內信號轉導和基因轉錄過程。很多中藥均可通過干預JAK/STAT信號通路調節癌細胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡[17]。葉水芬等[18]在神經細胞的研究中運用蓯蓉精水提取物與神經細胞共培養，通過Western blot、流式細胞術檢測JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax的蛋白表達及細胞的凋亡率發現，蓯蓉精可上調JAK2、STAT3的磷酸化水平，下調Bax蛋白表達、上調Bcl-2蛋白表達，抑制多巴胺能神經細胞凋亡。劉鵬等[19]在研究半枝蓮提取物的抗癌機制中闡明，其可通過失活JAK2/STAT3信號通路抑制前列腺癌細胞DU145的增殖，鼠乳腺癌4T1細胞的生長。

本研究檢測了50 μmol/ml黃芩素處理的膀胱癌T24細胞的p-JAK2、p-STAT3蛋白表達發現，黃芩素可下調p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達，且激活JAK/STAT信號通路可逆轉黃芩素對T24細胞遷移侵襲的抑制作用。

綜上所述，黃芩素可抑制膀胱癌細胞T24的遷移侵襲，其機制可能與失活JAK2/STAT3信號通路有關，為黃芩素治療膀胱癌提供理論和實驗支持。