宮頸癌組織及細胞株中長鏈非編碼RNA CCAT1的表達水平及意義①

王圣坦 朱根海 紀 武 洪 瀾 王 雁 陳春英 王 康

(海南省人民醫(yī)院婦科，海口 570311)

宮頸癌在發(fā)展中國家發(fā)病率居高不下，是婦科生殖道常見惡性腫瘤之一，我國宮頸癌發(fā)病率已高達萬分之一，且其發(fā)病年齡逐漸年輕化，嚴重威脅女性生命健康[1]。宮頸癌的發(fā)病機制復雜，涉及遺傳、環(huán)境等多種因素的影響，現(xiàn)有的醫(yī)療手段治療效果均不佳，近幾年隨著腫瘤分子學的發(fā)展，腫瘤分子靶點成為研究熱點[2]。研究顯示，長鏈非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的調(diào)控作用[3]；腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(colorectal cancer associated transcription factor 1，CCAT1)是一種長鏈非編碼RNA，據(jù)報道CCAT1參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4,5]，但國內(nèi)關(guān)于CCAT1與宮頸癌的報道較少，故本研究觀察了CCAT1在宮頸癌組織中表達情況和CCAT1對宮頸癌細胞增殖的影響，并初步分析其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本和細胞株 宮頸癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織(距癌<3 cm)取自2015年1月至2017年6月接受宮頸癌根治術(shù)的48例宮頸癌患者，所有患者術(shù)前均未接受放化療，且標本經(jīng)病理學檢查確診為宮頸癌；人正常宮頸鱗狀細胞系ECT1/E6E7，宮頸癌細胞株Hela、C33A長期凍存于實驗室液氮罐中，本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準，且患者均簽署知情同意書。

1.1.2試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000試劑盒、PCR引物購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；PimeScript RT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；Quanti-FastSYBR Green PCRKit熒光定量RCR試劑盒購自德國Qiagen公司；Tublin、RASSF1A、cyclin D1蛋白一抗購自美國Cell signaling technology公司；實時熒光定量PCR儀、酶標儀、全自動凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR檢測組織和細胞中CCAT1的表達 采用TRIzol法提取宮頸癌組織、癌旁正常組織及細胞樣本中總RNA，并用紫外分光光度計進行RNA定量及純度分析；參照PimeScript RT Reagent Kit說明書進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；參照QuantiFastSYBR Green PCRKit說明書進行qRT-PCR檢測；通過熔解曲線觀察PCR產(chǎn)物特異性，采用2-ΔΔCt法以GADPH mRNA的表達為內(nèi)參，分析CCAT1的相對表達水平。基因序列[6]如下：CCAT1上游引物：5′-TTTATGCTTGAGCCTTGA-3′，下游引物：5′-CTTGCCTGAAATACTTGC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。反應(yīng)條件為：92℃、3 min預變性，92℃、30 s變性，58℃、15 s退火，72℃、1 min延伸，共39個循環(huán)。

1.2.2細胞培養(yǎng) 宮頸癌細胞株Hela、C33A解凍后，應(yīng)用 DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混勻，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗，并作保種凍存。

1.2.3細胞分組與轉(zhuǎn)染 將細胞按適宜密度接種至6孔板，分組為正常對照組(Con)、siRNA-NC組和siRNA-CCAT1組，正常培養(yǎng)Hela、C33A細胞為Con組，Con組不作轉(zhuǎn)染處理；siRNA-NC組和siRNA-CCAT1組細胞用無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)，每6 h 換1次培養(yǎng)基，當細胞融合至40%～60%時，參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染24 h 后通過qRT-PCR檢測CCAT1的表達，選擇沉默效率較高的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4CCK-8檢測細胞增殖 將轉(zhuǎn)染后細胞按適宜密度接種至96孔板，參照CCK8試劑盒說明書檢測細胞增殖率，將Con組、siRNA-NC組和siRNA-CCAT1組細胞分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，每個時間點作5個復孔；每孔加入10 μl CCK-8試劑，37℃孵育1 h后終止培養(yǎng)，應(yīng)用酶標儀測定每孔在450 nm波長處的吸光值，并繪制折線圖。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期 待轉(zhuǎn)染后細胞融合至80%時收集起來，用預冷PBS緩沖液清洗細胞后，固定于甲醇中，4℃下孵育30 min，加入碘化丙啶染液，染色30 min，流式細胞儀進行細胞周期檢測。

1.2.6Western blot檢測細胞中RASSF1A、cyclin D1的表達 收集轉(zhuǎn)染后細胞，采用RIPA法提取樣品總蛋白，BCA法進行蛋白定量；取70 μg蛋白點樣至SDS-PAGE凝膠中電泳，當溴酚藍電泳至電泳儀底部時終止，再將凝膠中蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，浸沒于5%脫脂奶粉中，37℃下封閉1 h；適度清洗后浸沒于相應(yīng)蛋白一抗(Tublin稀釋比為1∶1 500、RASSF1A稀釋比為1∶1 000、cyclin D1稀釋比為1∶1 000)中，4℃下孵育過夜；適度清洗后浸沒于二抗(稀釋比為1∶8 000)中，室溫下孵育40 min；適度清洗后加入ECL發(fā)光液，于全自動凝膠成像系統(tǒng)中檢測蛋白圖像，并繪制柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1CCAT1在宮頸組織和細胞中的表達情況 如圖1，通過檢測宮頸組織和細胞中CCAT1的表達，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中CCAT1的表達顯著高于癌旁正常組織(2.28±0.85比1.15±0.53，t/P=7.816/0.000)；宮頸癌細胞Hela、C33A中CCAT1的表達分別顯著高于正常宮頸鱗狀細胞ECT1/E6E7(1.83±0.15比1.00±0.09，t/P=3.452/0.009；1.72±0.17比1.00±0.09，t/P=8.370/0.000)。

圖1 CCAT1在宮頸組織和細胞中的表達情況Fig.1 CCAT1 expression in cervical tissues and cellsNote: A.CCAT1 expression in cervical tissues;B.CCAT1 expression in cervical cells.Compared with normal cervical tissues or cells,*.P

表1 宮頸癌中CCAT1的表達與臨床病理表征的關(guān)系

Tab.1 Relationship between expression of CCAT1 in cervical cancer and clinicopathological features

ClinicopathologicalfeaturesnCCAT1 highexpressionCCAT1 lowerexpressionχ2PAge(year)0.1390.709>6018108≤60301515The degree of differentiation0.1670.683High differentiation-medium differentiation321616Poorly differentiated1697Tumor size(cm)5.4080.020>423167≤425916TMN staging10.3260.001Ⅰ-Ⅱ26818Ⅲ-Ⅳ22175Lymphatic metastasis6.9360.008Yes25196No23617

2.2宮頸癌中CCAT1的表達與臨床病理表征的關(guān)系 根據(jù)宮頸癌組織中CCAT1相對表達量的平均數(shù)為2.28，將48例宮頸癌患者分為CCAT1高表達組(CCAT1相對表達量>2.28)和CCAT1低表達組(CCAT1相對表達量≤2.28)，分別為25例和23例，分析CCAT1表達與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果表明TMN分期較晚、腫瘤大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者宮頸癌組織中CCAT1相對表達量更高(均P<0.05)；不同年齡、分化程度患者中CCAT1的表達無顯著性差異(均P>0.05)，見表1。

2.3沉默CCAT1后對Hela、C33A細胞中CCAT1表達的影響 如圖2，應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染細胞Hela、C33A后，發(fā)現(xiàn)siRNA-CCAT1組細胞中CCAT1表達明顯低于siRNA-NC組(Hela細胞：0.31±0.08比0.98±0.12，t/P=30.463/0.000；C33A細胞：0.36±0.07比1.05±0.11，t/P=33.266/0.000)；siRNA-NC組和Con組中CCAT1表達差異無顯著統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

圖2 沉默CCAT1后對Hela、C33A細胞中CCAT1表達的影響Fig.2 Effects of silencing CCAT1 on CCAT1 expression in Hela and C33A cellsNote: Compared with siRNA-NC group,*.P

圖3 沉默CCAT1后對Hela、C33A細胞增殖的影響Fig.3 Effects of silencing CCAT1 on proliferation of Hela and C33A cellsNote: A.Hela cell；B.C33A cell.Compared with siRNA-NC group,*.P

2.4沉默CCAT1后對Hela、C33A細胞增殖的影響 如圖3，通過CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后Hela、C33A細胞培養(yǎng)24 h、48 h及72 h的增殖活性，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞增殖的越緩慢，siRNA-CCAT1組細胞增殖活性明顯低于siRNA-NC組(均P<0.05)，siRNA-NC組和Con組中CCAT1表達差異無顯著統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具體吸光度值見表2。

2.5沉默CCAT1后對Hela、C33A細胞周期的影響 如圖4，通過流式細胞儀檢測Hela、C33A細胞周期，siRNA-CCAT1組處于G0/G1期細胞百分比顯著高于siRNA-NC組(均P<0.05)，而S期和G2/M期細胞百分比與siRNA-NC組差異無顯著統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具體值見表3。

圖4 沉默CCAT1后對Hela、C33A細胞周期的影響Fig.4 Effects on cell cycle of Hela and C33A after silenc-ing CCAT1Note: A.Hela cell；B.C33A cell.Compared with siRNA-NC group,*.P

GroupsHela24 h48 h72 hC33A24 h48 h72 hCon0.68±0.121.13±0.151.42±0.141.12±0.131.56±0.161.75±0.15siRNA-NC0.72±0.141.16±0.141.50±0.161.15±0.141.62±0.151.79±0.14siRNA-CCAT10.52±0.131)0.84±0.151)1.05±0.131)0.82±0.161)1.18±0.151)1.36±0.151)t2.3413.4874.8813.4714.6384.686P0.0470.0080.0010.0080.0020.002

Note：Compared with adjacent normal tissues,1)P<0.05.

GroupsHelaG0/G1SG2/MC33AG0/G1SG2/MCon42.58±5.2935.26±3.6223.42±3.2945.23±6.5438.55±5.9319.54±3.67siRNA-NC43.51±6.1734.53±4.1622.88±3.5744.56±5.8236.84±6.2720.13±4.08siRNA-CCAT152.37±5.471)29.27±3.8419.59±3.2261.27±6.941)28.73±6.7214.27±4.57t2.4032.0781.5304.1251.9732.139P0.0430.0710.1650.0030.0840.065

Note：Compared with adjacent normal tissues,1)P<0.05.

表4 沉默CCAT1后Hela、C33A細胞RASSF1A、cyclin D1表達情況

Tab.4 Expression of RASSF1A and cyclin D1 in Hela and C33A cells after silencing CCAT1

GroupsHelacyclin D1RASSF1AC33Acyclin D1RASSF1ACon0.97±0.091.06±0.061.07±0.100.98±0.08siRNA-NC1.00±0.081.00±0.101.00±0.091.00±0.06siRNA-CCAT10.59±0.151)1.83±0.161)0.43±0.131)2.06±0.141)t5.3939.8368.06115.561P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with adjacent normal tissues,1)P<0.05.

圖5 沉默CCAT1后對Hela、C33A細胞中RASSF1A、cyclin D1表達的影響Fig.5 Effects of silencing CCAT1 on expression of RASSF1A and cyclin D1 in Hela and C33A cellsNote: Compared with siRNA-NC group,*.P

2.6沉默CCAT1后對Hela、C33A細胞中RASSF1A、cyclin D1表達的影響 如圖5，與siRNA-NC組相比，siRNA-CCAT1組中cyclin D1表達顯著下調(diào)，RASSF1A表達顯著上調(diào)(均P<0.05)；siRNA-NC組和Con組中RASSF1A、cyclin D1的表達差異無顯著統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表4。

3 討論

長鏈非編碼RNA是一類高度保守、特異性強的長序列轉(zhuǎn)錄本，其生理活性豐富，涉及機體多種生理過程，甚至參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。長鏈非編碼RNA尿路上皮癌相關(guān)分子(UCA1)[8]、X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄子(XIST)[9]均在宮頸癌組織中異常高表達，且其表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征存在一定的關(guān)系，提示長鏈非編碼RNA可能參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。CCAT1 是一個長度為2 628 nt、位于癌基因cMyc附近的長鏈非編碼RNA[10]；研究發(fā)現(xiàn)，CCAT1可通過促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲過程，而參與胃癌[11]、結(jié)直腸癌[12]及前列腺癌[13]的發(fā)生發(fā)展。因此，猜想CCAT1在宮頸癌中可能具有相似作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CCAT1在宮頸癌組織和細胞中異常高表達，且不同TMN分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者中CCAT1表達有顯著差異，提示CCAT1可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，與Zhang等[14]研究報道相似。

人體正常細胞在癌變、增殖、轉(zhuǎn)移、復發(fā)等過程中伴隨著多種基因的變異，從而引起相關(guān)功能蛋白表達的紊亂，故RNA干擾技術(shù)常應(yīng)用于腫瘤的基因治療與研究。本研究通過構(gòu)建CCAT1低表達細胞系，探究沉默CCAT1后對宮頸癌細胞Hela、C33A增殖的影響，結(jié)果顯示沉默CCAT1會顯著抑制宮頸癌細胞的增殖，并使細胞停滯于G0/G1期。RAS相關(guān)區(qū)域家族1A蛋白(RAS correlation region family 1A，RASSF1A)是一種抑癌基因，其表達缺失會促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可能通過誘導細胞周期停滯或引起細胞惡性轉(zhuǎn)換；張秀平等[15]研究顯示RASSF1A在宮頸癌組織中異常低表達，并抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲。細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)可與多種蛋白相互作用，促使細胞周期由G1期進入S期，誘導細胞的分裂與增殖；研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1異常過表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且與腫瘤患者臨床病歷特征及預后相關(guān)。廖銘心等[16]研究顯示沉默hnRNP A2/B1基因通過下調(diào)cyclin D1的表達，抑制宮頸癌細胞增殖及生長。據(jù)報道，CCAT1可通過與miR-181a-5p互補配對調(diào)控上調(diào)RASSF1A、下調(diào)cyclin D1的表達，從而發(fā)揮抑癌作用[17]，本研究發(fā)現(xiàn)沉默CCAT1表達后會上調(diào)Hela、C33A細胞中RASSF1A、下調(diào)cyclin D1的表達，可能因此影響宮頸癌細胞的增殖能力。

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機制錯綜復雜，CCAT1作為一個新型的腫瘤調(diào)控分子，其具體作用機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)沉默CCAT1表達可抑制宮頸癌細胞的增殖，使細胞停滯于G0/G1期，可能與調(diào)控RASSF1A、cyclin D1的表達有關(guān)，為揭示宮頸癌發(fā)生發(fā)展機制打下基礎(chǔ)，但本文僅初步分析其具體作用機制，后期隨著CCAT1與宮頸癌的深入研究，CCAT1將有望成為治療宮頸癌的重要靶點。