外周血NK細胞動態監測與遺傳性易栓癥患者妊娠結局的相關性研究①

阮加里 朱 丹 李陽陽 Kwak-Kim Joanne 鮑時華

(同濟大學附屬第一婦嬰保健院生殖免疫科，上海 201204)

臨床上習慣將復發性流產(recurrent spontaneous abortion,RSA)和反復種植失敗(recurrent implantation failure，RIF)統稱為反復妊娠失敗(recurrent reproductive failure,RRF)[1]，盡管目前尚沒有特別針對RRF的規范化診療指南或專家共識，但普遍認為適用于RSA的病因篩查和治療策略可能同樣也適用于RRF。引起RSA的病因有染色體異常、解剖因素、內分泌因素、感染因素等[2]，但在常規病因篩查后，仍有近50%的患者病因不明[3,4]，近年來的研究認為免疫異常及血栓前狀態可能為其潛在病因[5]。

血栓前狀態(prethrombotic state,PTS) 或稱之為易栓癥，分遺傳性和獲得性兩類，有時兩者可同時存在。抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome,APS)作為獲得性易栓癥中最常見的一種，可加重妊娠高凝狀態,增加胎盤多發性小血栓形成、蛻膜血管纖維素樣壞死、胎盤血流低灌注發生的概率，從而導致胎盤形成或胚胎著床失敗，最終造成妊娠失敗[6,7]。而遺傳性易栓癥(inherited thrombophilia,IT)是指由于抗凝蛋白缺乏、凝血因子缺乏、纖溶蛋白缺陷或代謝缺陷所引起的易發生血栓的一類疾病，相關研究顯示在半數以上的反復種植失敗患者的血液中可檢測到至少一種IT表型[8]。胚胎對于母體來說是半同種異體移植物，正常妊娠是一種成功的半同種異體移植現象，母體免疫系統能否識別并耐受胚胎抗原，將直接影響妊娠的建立與維持，而母-胎界面則是妊娠建立和維持的關鍵部位[9]。其中自然殺傷細胞(natural killer cell，NK) 在妊娠免疫調節中發揮著重要作用，外周血NK細胞(peripheral NK,pNK)有較強的殺傷活性，具有良好的抗病毒和抗腫瘤活性，而子宮NK(uterine NK,uNK)細胞分泌細胞因子，尤其是血管生成因子，在調節滋養細胞侵襲和血管生成中扮演了重要的角色[10]。

易栓癥與免疫之間的聯系尚待進一步研究揭示，目前相關的文獻報道較少，本課題組在多年的臨床實踐中發現易栓癥和NK細胞異常兩者高度相關，且近來的一些研究也顯示RSA合并APS的患者較RSA患者有著更高的NK細胞水平[11]，因此我們猜測易栓因素可能與免疫因素有著潛在關聯，鑒于目前缺乏針對遺傳性易栓癥患者群體的相關研究，本研究旨在通過回顧性分析178例反復妊娠失敗合并遺傳性易栓癥患者的臨床資料，探討外周血NK細胞數量及殺傷活性與患者再次妊娠結局的關系。這將加深我們對此類疾病的認識，并對此類患者的病因篩查及后續治療提供參考。

1 材料與方法

1.1研究對象 采用回顧性隊列研究設計，納入2009年1月至2013年12月期間在Reproductive Medicine,Department of Obstetrics and Gynecology,Chicago Medical School at Rosalind Franklin University of Medicine and Science就診的未孕反復妊娠失敗患者，包括RSA和RIF。在該中心，反復妊娠失敗患者均接受包括解剖因素(如宮腔黏連、子宮畸形、子宮內膜息肉等)、內分泌因素(如胰島素抵抗、甲狀腺功能減退、高泌乳素血癥、糖尿病、高雄激素血癥等)、免疫因素以及血栓前狀態(包括獲得性和遺傳性易栓癥)在內的常規篩查，篩選出其中合并有遺傳性易栓癥的患者作為本次研究的研究對象，記錄患者孕前和孕期各類影像學和實驗室檢測檢查結果、用藥情況以及妊娠結局等信息。納入標準：①25歲至45歲女性；②診斷為復發性流產患者(連續在妊娠20周以內發生2次及2次以上自然流產)和/或診斷為反復種植失敗患者(移植≥3次優質胚胎或多次移植胚胎數量總計≥10枚而仍未能獲得臨床妊娠者)；③患有遺傳性易栓癥，即常見篩查項目見表1。主要排除標準：①夫婦染色體異常；②排卵障礙及月經不規則；③抗凝藥物過敏；④子宮因素，如子宮畸形、肌瘤、息肉和宮腔黏連等；⑤自身免疫性疾病。本研究經Chicago Medical School at Rosalind Franklin University of Medicine and Science倫理委員會審核批準，患者均簽有知情同意書。

1.2方法

1.2.1子宮生物物理評分 通過超聲檢查測量子宮內膜厚度、子宮內膜線、子宮內膜蠕動波、子宮肌層回聲、子宮動脈血流、內膜血流以及肌層血流，最終計算子宮生物物理評分[12]。

1.2.2pNK細胞百分數的測定 分別在孕前及孕期每2周采集患者肘靜脈血于EDTA-K2 2.0 mg/ml抗凝管備測。將分離得到的PBMCs用PBS洗滌2次，取100 μl的PBMCs加入含1%胎牛血清和0.09%(w/v)疊氮鈉的PBS緩沖液(染色緩沖液)洗滌2次后加入CD3-FITC、CD45-Percip和CD16/CE56-PE(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)進行染色，加入250 μl Cytofix/Cytoperm細胞固定/通透液進行固定和通透后，使用BD公司的FASC Calibur流式細胞儀進行免疫熒光及四色流式細胞分析。

1.2.3pNK細胞殺傷活性的測定 分別在孕前及孕期每兩周采集患者肘靜脈血于EDTA-K2 2.0 mg/ml抗凝管備測。將對數期的K562與處理好的PBMCs以50∶1的比例混合，在37℃，5%CO2的條件下孵育2 h，在檢測前15 min加入100 μl碘化丙啶標記死亡細胞，同樣使用BD流式細胞儀進行檢測與分析，通過計算K562細胞的死亡率來檢測NK細胞對K562細胞的殺傷作用，從而反映NK細胞殺傷活性。

2 結果

2.1患者一般情況 回顧性分析2009年1月至2013年12月在Department of Obstetrics and Gyneco-logy,Chicago Medical School at Rosalind Franklin University of Medicine and Science就診的178例RPF合并遺傳性易栓癥患者的臨床資料，其中141例為RSA患者，37例為RIF患者。研究對象平均年齡為35.22歲，平均BMI指數為25.15 kg/m2，具體遺傳性易栓癥表型見表1。其中76.40%的患者MTHFR基因多態性呈現雜合或純合突變，68.36%的患者PAI-Ⅰ基因多態性呈現雜合或純合突變，而Factor-Ⅱ基因突變率最低僅1例(0.56%)。在本研究中外周血NK細胞百分數增高的陽性率為22.48%，NK細胞殺傷活性增高的比例為50.56%。所有納入研究的患者均在孕前(RSA患者于排卵期，RIF患者于移植前1周)及孕后(確認妊娠后)接受強的松(5 mg qd po)和/或靜脈注射免疫球蛋白G[體重×(250～300)mg/kg ivgtt q2w，2～3次]以及抗凝(低分子肝素5 000 U qd IH和小劑量阿司匹林81 mg qd po)治療。

2.2外周血NK細胞百分數及殺傷活性在孕前及孕期的動態變化 根據再次妊娠結局的不同，研究對象被分為流產組和活產組。圖1A和B分別為pNK%及pNK殺傷活性在孕前及孕期各周的分布圖。相同時期，流產組pNK%及NK細胞殺傷活性均高于活產組，其中孕前及孕6周時，差異具有統計學意義(P=0.04，P=0.03；P=0.02，P=0.04)。

表1 患者一般資料

Tab.1 Basic characteristics

2.3外周血NK細胞百分數與殺傷活性之間的關系 外周血NK細胞百分數與NK細胞殺傷活性分別從數量和生物活性兩方面反映NK細胞狀態，兩者之間有無相關性或共線性， 需要分析驗證。經相關性檢驗(圖2A、B)，孕前及孕6周NK細胞百分數與NK細胞殺傷活性之間存在一定的正相關(r=0.37，95% CI 0.23～0.49，P=0.000 1；r=0.24，95%CI 0.05～0.40，P=0.01)。而共線性分析顯示孕前及孕后NK細胞百分數與NK細胞殺傷毒性共線性方差擴大因子(variance inflation factor，VIF)分別為1.2和1.1，說明NK細胞百分數與殺傷活性兩個自變量之間不存在非完全共線性，可以構建線性回歸模型。

圖1 外周血NK細胞百分數及殺傷活性在孕前及孕期的動態變化Fig.1 Dynamic changes of peripheral NK cells perc-entage and cytotoxicity before and during pregnancyNote: A.*.P=0.04,**.P=0.03;B.#.P=0.02,##.P=0.04.

圖2 外周血NK細胞百分數與殺傷活性間的關系Fig.2 Correlation between percentage and cytotoxicity of pNK cellsNote: A.Before pregnancy,r=0.3687,95%CI 0.234 0-0.489 6,P=0.000 1;B.At 6 gestational weeks:r=0.232 7,95%CI 0.050 1-0.400 2,P=0.013 1.

表2 pNK 百分數與不良妊娠結局的關系

Tab.2 Association between pNK percentage and subsequent pregnancy outcomes

VariableNon-adjustedOR 95%CIP valueAdjust Ⅰ1)OR 95%CIP valueAdjustⅡ2)OR 95%CIP valuepNK percentage at baseline<121.01.01.0≥122.98(1.31-6.81)0.009 55.13(1.84-14.30)0.001 84.75(1.57-14.32)0.005 7pNK percentage at 6 gestational weeks<121.01.01.0≥122.52(0.88-7.26)0.085 63.43(1.03-11.46)0.043 36.77(1.06-43.11)0.042 9

Note：1)Adjust Ⅰ model adjust for:Age;BMI;Uterine biophysical score;2)Adjust Ⅱ model adjust for:Age;BMI;Uterine biophysical score,pNK cytotoxicity.

表3 pNK殺傷活性與不良妊娠結局的關系

Tab.3 Association between pNK cytotoxicity and subsequent pregnancy outcomes

VariableNon-adjustedOR 95%CIP valueAdjust Ⅰ1)OR 95%CIP valueAdjustⅡ2)OR 95%CIP valuepNK cytotoxicity at baseline<151.01.01.0≥151.57(0.70-3.53)0.274 91.28(0.51-3.21)0.605 50.84(0.30-2.36)0.7443pNK cytotoxicity at 6 gestational weeks<151.01.01.0≥153.23(1.12-9.62)0.029 52.55(0.80-8.10)0.111 51.81(0.54-6.10)0.340 0

Note：1)Adjust Ⅰ model adjust for:Age;BMI;Uterine biophysical score；2)Adjust Ⅱ model adjust for:Age;BMI;Uterine biophysical score,pNK percentage.

2.4外周血NK細胞百分數及殺傷活性與再次妊娠結局 本研究中，將pNK%≥12%定義為陽性，<12%則為陰性。孕前及孕6周pNK%陽性者再次流產率高于陰性者(OR 2.98,95%CI 1.3～6.81,P=0.01;OR 2.52,95%CI 0.88～7.26,P=0.09)。在調整包括年齡、BMI、子宮生物物理評分在內的協變量后，差異具有統計學意義(OR 5.13,95%CI 1.84～14.3,P=0.01 and OR 3.43,95%CI 1.03～11.46,P=0.04)(表2,調整Ⅰ)。考慮到pNK%與pNK殺傷活性相關，我們再次調整殺傷活性指標(表2，調整Ⅱ)，最終顯示孕前陽性組流產率為陰性組的4.75倍(OR 4.75,95%CI1.57～14.32,P=0.01)，孕6周時則為6.77倍(OR 6.77,95%CI 1.06～43.11,P=0.04)。

同法分析pNK殺傷活性與后續妊娠結局的關系。將殺傷活性≥15%定義為陽性，孕6周時陽性組較陰性組有更高的流產率(OR 3.23,95%CI 1.12～9.62,P=0.03)(表3)，但在調整相關協變量后，差異不具有統計學差異。

3 討論

免疫因素被認為在復發性流產、反復胚胎移植失敗、不孕等生殖問題中扮演了重要的角色。成功的妊娠需要母體免疫系統對“同種異體移植物”胚胎產生耐受。而NK細胞作為固有免疫系統的一部分，占外周血淋巴細胞的5%～10%，占子宮內膜淋巴細胞的70%～90%，在人類的整個妊娠過程中發揮著重要作用。外周血NK細胞主要為CD56dimCD16+，具有較強的殺傷活性，是抵御病毒入侵和控制腫瘤早期擴散的首要防線，而子宮NK細胞則主要為CD56brightCD16-，分泌大量的細胞因子，如白介素8、干擾素誘導蛋白、金屬蛋白酶及血管生成因子等，促進滋養層細胞侵襲、修復與重建子宮動脈、改善胚胎血供、維持滋養細胞侵襲和胎盤形成之間的平衡[10]。NK細胞數量或殺傷活性是否與不良妊娠結局有關已成為近年來的研究熱點，而APS作為獲得性易栓癥中最常見的一種，被認為是導致復發性流產的重要原因，相關研究發現RSA合并APS的患者較RSA患者有著更高的NK細胞水平[11]，因此我們猜測易栓因素可能與免疫因素有著潛在關聯。盡管遺傳性易栓癥與不良妊娠結局的關系仍存爭議，但不可否認，仍有一些研究發現遺傳性易栓癥患者有更高的流產發生率[13-15]。因此本研究選定反復妊娠失敗合并遺傳性易栓癥患者為研究對象。

相關研究提示我們異常的NK細胞數量及殺傷活性或與不良妊娠結局相關[16-19]，而升高的pNK細胞水平及殺傷活性可以預測下次妊娠時正常染色體核型胚胎有較高的發生流產或生化妊娠的可能[20,21]。本研究中我們也發現孕前和孕6周時pNK%為妊娠結局的獨立危險因素，且和Michou等[22]及Thum等[23]的研究結果一致，pNK%≥12%可能預示著更高的再次流產發生率。但與一些研究結果不同的是，本研究中增高的pNK細胞殺傷活性并非不良妊娠結局的獨立危險因素。這可能與研究對象均為有反復妊娠失敗合并遺傳性易栓癥患者而非正常人群有關。pNK細胞殺傷活性和數目的正常范圍至今為止尚無共識，但鑒于越來越多的證據提示我們NK細胞的調節異常及遺傳性易栓癥可能與一些不良妊娠結局相關，NK細胞參數的檢測以及遺傳性易栓癥的篩查被應用于臨床，從而出現了使用低分子肝素及阿司匹林改善遺傳性易栓癥妊娠結局[24,25]，強的松、靜脈滴注免疫球蛋白 (IVIG)及脂肪乳[1,26-28]降低NK細胞水平及殺傷活性，傳統中醫補腎益氣方誘導pNK細胞向耐受型轉變的經驗性治療[29]，但對此學術界是爭議不斷，仍需要進一步大樣本的研究來為臨床治療提供依據。

綜上，對于反復妊娠失敗合并遺傳性易栓癥的患者來說，外周血NK細胞百分數和殺傷活性與更高的再次流產率相關，但在孕前及孕6周時只有外周血NK細胞百分數為其獨立危險因素。目前仍需進一步研究來確定pNK細胞百分數和殺傷活性的正常范圍，幫助選擇可能從治療中受益的患者人群。此外，本研究為回顧性研究，通過調整協變量(年齡、BMI、子宮生物物理評分等)來降低偏倚，但本研究結論尚待大樣本、高質量、多中心參與的研究加以驗證。