K+對促進甲基對硫磷水解酶催化活性的影響

石誠，劉松，堵國成

1(江南大學,糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫, 214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫, 214122)

有機磷農藥在當今農業生產中扮演著不可或缺的角色，包括甲基對硫磷、甲異呋喃、單氯磷、樂果等[1]。有機磷農藥的大量使用帶來了土壤污染、水資源污染及農藥殘留等問題[1-2]。甲基對硫磷水解酶(methyl parathion hydrolase, MPH)作為一類有機磷降解酶，可有效水解甲基對硫磷等有機磷農藥[3-4]，在有機磷農藥殘留檢測和清洗劑領域具有良好的應用前景。與色譜檢測法[5]、免疫分析法[6]、酶抑制法[7-9]相比，基于MPH的傳感器檢測方具有簡單、快速、成本低廉、檢測儀器體積小等優勢[7]。以MPH為主要功能成分的“比亞酶”成為2008年北京奧運會和2010年上海世博會的果蔬產品指定的洗滌用品[10]。

研究表明，表面活性劑(Tween-20、Tween-80及十二烷基硫酸鈉等)和部分鹽離子(Cd2+、Ni2+、Zn2+及Cu2+)能抑制MPH催化活性，而Na+、K+、Ca2+、Co2+及Mn2+對MPH催化有促進作用[11]。一般認為，鹽離子通過與催化活性基團的相互作用來抑制MPH的催化活性。例如，添加Cd2+能破壞MPH催化活性中心His與2個Cd2+、1個水分子形成金屬中心，從而抑制催化活性[4]。鹽離子促進MPH催化活性的機理尚未報道。

近年來，研究者已發展多種理論分析蛋白質-配體相互作用的方法，如分子對接[12-13]、分子動力學(molecular dynamics，MD)[14]、量子力學/分子力學聯用[15-16]等。分子對接可靜態的展示蛋白質結構與配體的相對位置，但可靠性不如MD[17-19]。UL-HAQ等[20]利用MD揭示了酪蛋白激活酶Ⅱ與抑制劑的結合模式及抑制機理，并利用此機理設計新的抑制劑。POTTERTON等[21]基于轉向分子動力學計算了G蛋白與配體的相對結合時間。POTTERTON 等[21]結合三維結構模擬及MD發現了真核延伸因子-2激酶與其抑制劑的結合機理[21]。上述研究為揭示鹽離子調控MPH的機制提供了方法學基礎。

在本研究中，首先考察了不同濃度K+對Pseudomonassp. WBC-3 MPH的催化活性的影響，通過MD分析了MPH與K+結合-分離的動態過程，并基于分布概率及定點突變分析確定了MPH中與K+相互作用的關鍵氨基酸位點。研究結果將為MPH催化活性的改造提供有效靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

編碼Pseudomonassp. WBC-3 MPH基因(PDB：1P9E)的載體pET-20b/MPH,于本實驗室前期構建。克隆宿主E.coliJM109和表達宿主E.coliBL21(DE3),購于美國Invitrogen公司。Prime STAR HS DNA聚合酶和膠回收試劑盒,購于Takara公司；甲基對硫磷,購于北京壇墨質檢科技有限公司；Ni2+親和柱、脫鹽柱,購于GE Healthcare公司。CloneExpress Ⅱ聚合酶購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 定點突變質粒的構建

以pET-20b/MPH為模板，通過全質粒PCR擴增構建得到編碼MPH突變體基因的表達質粒。引物對E94A-F/E94A-R和N329A-F/N329A-R，分別對應突變體E94A和N329A。PCR條件為：98 ℃、10 s，64 ℃、5 s，72 ℃、5 min，34個循環。Dpn I消化PCR產物2 h后膠回收，經磷酸化后過夜連接，并轉化E.coliJM109，并進行基因測序驗證。從E.coliJM109中提取質粒轉化至E.coliBL21 (DE3)，獲取陽性轉化子(表1)。

表1 MPH突變基因擴增引物序列

注：下劃線指突變位點

1.2.2 重組菌的搖瓶發酵

卡那霉素平板上活化12 h后，挑取單菌落接種于LB培養基，37 ℃、220 r/min振蕩過夜培養。以1%的接種量將種子液轉接與TB培養基，37 ℃、220 r/min振蕩培養至OD600為0.6。加入1 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)于25 ℃誘導24 h。

1.2.3 蛋白質純化

離心收集菌體，2倍體積50 mmol/L磷酸緩沖液洗滌菌體3遍，并超聲波破碎30 min。細胞破碎液于12 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清液Ni2+親和柱上樣，20～500 mmol/L 咪唑梯度洗脫，將含MPH的洗脫液于脫鹽柱脫鹽，純酶保存于50 mmol/L pH為7.0的Tris-HCl緩沖液中。

1.2.4 鹽離子對MPH酶活的影響

用50 mmol/L pH為8.9 的Tris-HCl緩沖液分別配制含3 mol/L NaCl和KCl的含鹽緩沖液，并將其稀釋至0.2～2 mol/L。測定不同鹽濃度條件下MPH催化活性。

1.2.5 酶活檢測

MPH酶活單位定義：在30 ℃，pH 為8.9的Tris-HCl緩沖體系中，每分鐘催化甲基對硫磷生產1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量。建立對硝基苯酚在405 nm吸光度值與濃度的標準曲線，以甲基對硫磷為底物測量酶活。

1.2.6 分子動力學模擬

利用分子動力學分析軟件Amber (http://ambermd.org/)模擬K+與MPH相互作用。分析過程如下：基于ff14SB力場構建MPH的溶劑盒子，并添加平衡離子及1 mol/L K+；使用共軛梯度法對整個體系能量最小化；將體系逐步升溫至310 K，并于此溫度使體系平衡，并持續20 μs。

2 結果與分析

2.1 鹽離子對MPH酶活的影響

為考查鹽離子對MPH活性的影響，分別測定不同KCl及NaCl濃度下MPH的催化活性。如圖1所示，隨著KCl濃度提高至2 mol/L，MPH活性迅速提高；KCl濃度達到3 mol/L時，MPH活力較無KCl時提高13.39倍。然而，增加NaCl濃度并未能使MPH活性明顯提高。上述結果表明，K+能促進MPH的催化反應。

圖1 鹽離子對MPH酶活的影響

2.2 MPH氨基酸殘基臨近區域K+分布概率的預測

2.2.1 K+分布概率計算方法的建立

為分析K+與MPH的相互作用，對兩者混合體系進行MD分析預測K+與MPH可能的作用位點。為防止K+初始位置對MD分析結果的影響，分別將K+和MPH置于溶劑盒子外圍和中央。在300 K下運行MD，6 000 ps 后RMSD趨于平緩，此時K+已分布于整個溶劑盒子，MD體系達到平衡。繼續運行20 ns，每2 ps 取1次樣，即共10 000次取樣。在MD分析過程中，以MPH某原子為中心的圓形區域(半徑為R)出現K+的幀數與總幀數的比值定義為原子臨近區域K+分布概率，氨基酸殘基中原子臨近區域K+分布概率的最大值則定義為該氨基酸臨近區域K+分布概率。

上述離子分布概率的預測方法可用于表征K+與MPH氨基酸殘基的相互作用，但MPH原子鄰近區域半徑和K+隨機運動會影響預測方法的準確性。

2.2.2 MPH原子鄰近區域半徑對K+分布概率預測的影響

氨基酸殘基僅能與一定范圍的K+產生有效的相互作用，設定過大的MPH原子鄰近區域半徑會引入氨基酸與離子相互作用之外的噪音。因此，分別計算3、4、 5 ? K+在氨基酸殘基附近的分布概率。不同的分布半徑顯示了一致的K+分布規律。MPH原子鄰近區域半徑越大，MPH原子鄰近區域K+分布概率越大，但同時引入了大量噪音(圖2)。因此，選擇3 ?作為MPH原子鄰近區域半徑。

a-3?；b-4?；c-5?

2.2.3 水溶劑主體中K+隨機運動對K+分布概率預測的影響

K+在水溶劑主體中的隨機運動和初始位置可能影響MPH氨基酸殘臨近區域K+分布概率預測。為消除初始位置對計算結果的影響，在運行MD前使K+遠離MPH。MD分析顯示，K+隨機運動的平均RMSF為60 ?(圖3)，遠大于而溶劑盒子的半徑10 ?。上述結果，在20 ns分析范圍內，設定的MD分析體系中各區域K+與MPH具有同等的接觸機會。

圖3 K+在水溶劑中的RMSF分析

2.2.4 MPH氨基酸殘基臨近區域K+隨機運動對K+分布概率預測的影響

基于酶學分析的結果，K+通過與特定氨基酸殘的相互作用來改變酶的催化特性。然而，K+遷移至MPH氨基酸殘基臨近區域時，其隨機運動有干擾K+分布概率預測的可能。參照蛋白質分子中“氫鍵壽命”，定義了氨基酸臨近區域K+壽命(MPH氨基酸殘基臨近區域K+連續出現的幀數所對應的時間)。MD分析顯示，氨基酸殘基臨近區域中單個K+最長壽命與該區域內總體K+最長壽命基本一致(圖4)。因此，MPH氨基酸殘基臨近區域K+隨機運動對K+分布概率預測的影響不明顯。

a-單個K+；b-總體k+

2.3 K+與MPH關鍵作用位點分析

MPH與1 mol/L K+的MD分析顯示，臨近區域K+分布概率大于5%的原子數僅占MPH總原子數的1.19%(圖5-a)。這表明MPH中絕大部分K+分布概率較低。故分析統計臨近區域K+分布概率大于5%的氨基酸殘基數量，以確定K+作用的氨基酸偏好性。分析結果顯示，臨近區域K+分布概率大于5%的氨基酸殘基數量最多的是Asp，其次是Glu、Gln和Asn(圖5-b)。這說明K+主要偏好酸性氨基酸，其次偏好于酰胺類氨基酸。

a-高于某分布概率原子的占比；b-氨基酸殘基對K+的偏好性

為考察K+對MPH蛋白結構的影響，通過MD分析了MPH結構柔性值RMSF。結果顯示，相對于無K+條件下，1 mol/L K+顯著降低了MPH 中A85-T95與V323-N329的RMSF，表明2個區域柔性明顯下降(圖6-a)。在A85-T95中，臨近區域K+分布概率大于5%的氨基酸殘基為 K90(0.061 8)、P92(0.057 4)、E94(0.1250)。其中，K90與P92臨近區域K+分布概率主要受E94影響，故后者可能是該區域內與K+作用的關鍵氨基酸。在V323-N329，臨近區域K+分布概率大于5%的氨基酸殘基分別為S326(0.208 5)、V327(0.254)、N329(0.181)。其中，S326與V327臨近區域K+分布概率主要受N329影響，故后者可能是該區域內與K+作用的關鍵氨基酸。

a-MPH氨基酸殘基；b-MPH突變體

通過丙氨酸取代，進一步驗證E94與N329對K+作用的影響。與野生酶相比，E94A與N329A的相對酶活(1 mol/L K+/0 mol/L K+溶液)分別降低26%與33%，組合變體 E94A/N329A的降低53%(圖6-b)。上述結果表明，E94與N329是K+調控MPH催化活性的關鍵位點。

3 結論

鹽離子是影響酶催化性能的重要因素。研究發現，K+濃度對Pseudomonassp. WBC-3 MPH催化活性有重要影響。基于MPH進行分子動力學分析，建立了MPH氨基酸殘基臨近區域K+分布概率的預測方法。在1 mol/L K+溶液中，K+傾向分布于MPH的Asp、Glu、Gln及Asn殘基附近，并降低了A85-T95與V323-N329的柔性。將A85-T95與V323-N329柔性變化最大的E94與N329分別突變為Ala，使MPH相對催化活性(1 mol/L K+溶液/0 mol/L K+溶液)分別較野生酶降低26%與33%，兩者同時突變為Ala，其相對活性降低53%。因此，K+可能通過與E94、N329相互作用來調控MPH催化，為其催化活性的分子改造提供了靶點。研究結果也為其它酶受鹽離子調控的機制及確定改造靶點提供參考。