K+對(duì)促進(jìn)甲基對(duì)硫磷水解酶催化活性的影響

石誠(chéng)，劉松，堵國(guó)成

1(江南大學(xué),糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫, 214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫, 214122)

有機(jī)磷農(nóng)藥在當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中扮演著不可或缺的角色，包括甲基對(duì)硫磷、甲異呋喃、單氯磷、樂(lè)果等[1]。有機(jī)磷農(nóng)藥的大量使用帶來(lái)了土壤污染、水資源污染及農(nóng)藥殘留等問(wèn)題[1-2]。甲基對(duì)硫磷水解酶(methyl parathion hydrolase, MPH)作為一類(lèi)有機(jī)磷降解酶，可有效水解甲基對(duì)硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥[3-4]，在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)和清洗劑領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。與色譜檢測(cè)法[5]、免疫分析法[6]、酶抑制法[7-9]相比，基于MPH的傳感器檢測(cè)方具有簡(jiǎn)單、快速、成本低廉、檢測(cè)儀器體積小等優(yōu)勢(shì)[7]。以MPH為主要功能成分的“比亞酶”成為2008年北京奧運(yùn)會(huì)和2010年上海世博會(huì)的果蔬產(chǎn)品指定的洗滌用品[10]。

研究表明，表面活性劑(Tween-20、Tween-80及十二烷基硫酸鈉等)和部分鹽離子(Cd2+、Ni2+、Zn2+及Cu2+)能抑制MPH催化活性，而Na+、K+、Ca2+、Co2+及Mn2+對(duì)MPH催化有促進(jìn)作用[11]。一般認(rèn)為，鹽離子通過(guò)與催化活性基團(tuán)的相互作用來(lái)抑制MPH的催化活性。例如，添加Cd2+能破壞MPH催化活性中心His與2個(gè)Cd2+、1個(gè)水分子形成金屬中心，從而抑制催化活性[4]。鹽離子促進(jìn)MPH催化活性的機(jī)理尚未報(bào)道。

近年來(lái)，研究者已發(fā)展多種理論分析蛋白質(zhì)-配體相互作用的方法，如分子對(duì)接[12-13]、分子動(dòng)力學(xué)(molecular dynamics，MD)[14]、量子力學(xué)/分子力學(xué)聯(lián)用[15-16]等。分子對(duì)接可靜態(tài)的展示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與配體的相對(duì)位置，但可靠性不如MD[17-19]。UL-HAQ等[20]利用MD揭示了酪蛋白激活酶Ⅱ與抑制劑的結(jié)合模式及抑制機(jī)理，并利用此機(jī)理設(shè)計(jì)新的抑制劑。POTTERTON等[21]基于轉(zhuǎn)向分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算了G蛋白與配體的相對(duì)結(jié)合時(shí)間。POTTERTON 等[21]結(jié)合三維結(jié)構(gòu)模擬及MD發(fā)現(xiàn)了真核延伸因子-2激酶與其抑制劑的結(jié)合機(jī)理[21]。上述研究為揭示鹽離子調(diào)控MPH的機(jī)制提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

在本研究中，首先考察了不同濃度K+對(duì)Pseudomonassp. WBC-3 MPH的催化活性的影響，通過(guò)MD分析了MPH與K+結(jié)合-分離的動(dòng)態(tài)過(guò)程，并基于分布概率及定點(diǎn)突變分析確定了MPH中與K+相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。研究結(jié)果將為MPH催化活性的改造提供有效靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

編碼Pseudomonassp. WBC-3 MPH基因(PDB：1P9E)的載體pET-20b/MPH,于本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。克隆宿主E.coliJM109和表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3),購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。Prime STAR HS DNA聚合酶和膠回收試劑盒,購(gòu)于Takara公司；甲基對(duì)硫磷,購(gòu)于北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；Ni2+親和柱、脫鹽柱,購(gòu)于GE Healthcare公司。CloneExpress Ⅱ聚合酶購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 定點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建

以pET-20b/MPH為模板，通過(guò)全質(zhì)粒PCR擴(kuò)增構(gòu)建得到編碼MPH突變體基因的表達(dá)質(zhì)粒。引物對(duì)E94A-F/E94A-R和N329A-F/N329A-R，分別對(duì)應(yīng)突變體E94A和N329A。PCR條件為：98 ℃、10 s，64 ℃、5 s，72 ℃、5 min，34個(gè)循環(huán)。Dpn I消化PCR產(chǎn)物2 h后膠回收，經(jīng)磷酸化后過(guò)夜連接，并轉(zhuǎn)化E.coliJM109，并進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證。從E.coliJM109中提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3)，獲取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(表1)。

表1 MPH突變基因擴(kuò)增引物序列

注：下劃線指突變位點(diǎn)

1.2.2 重組菌的搖瓶發(fā)酵

卡那霉素平板上活化12 h后，挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。以1%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接與TB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6。加入1 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)于25 ℃誘導(dǎo)24 h。

1.2.3 蛋白質(zhì)純化

離心收集菌體，2倍體積50 mmol/L磷酸緩沖液洗滌菌體3遍，并超聲波破碎30 min。細(xì)胞破碎液于12 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清液Ni2+親和柱上樣，20～500 mmol/L 咪唑梯度洗脫，將含MPH的洗脫液于脫鹽柱脫鹽，純酶保存于50 mmol/L pH為7.0的Tris-HCl緩沖液中。

1.2.4 鹽離子對(duì)MPH酶活的影響

用50 mmol/L pH為8.9 的Tris-HCl緩沖液分別配制含3 mol/L NaCl和KCl的含鹽緩沖液，并將其稀釋至0.2～2 mol/L。測(cè)定不同鹽濃度條件下MPH催化活性。

1.2.5 酶活檢測(cè)

MPH酶活單位定義：在30 ℃，pH 為8.9的Tris-HCl緩沖體系中，每分鐘催化甲基對(duì)硫磷生產(chǎn)1 μmol 對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。建立對(duì)硝基苯酚在405 nm吸光度值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以甲基對(duì)硫磷為底物測(cè)量酶活。

1.2.6 分子動(dòng)力學(xué)模擬

利用分子動(dòng)力學(xué)分析軟件Amber (http://ambermd.org/)模擬K+與MPH相互作用。分析過(guò)程如下：基于ff14SB力場(chǎng)構(gòu)建MPH的溶劑盒子，并添加平衡離子及1 mol/L K+；使用共軛梯度法對(duì)整個(gè)體系能量最小化；將體系逐步升溫至310 K，并于此溫度使體系平衡，并持續(xù)20 μs。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽離子對(duì)MPH酶活的影響

為考查鹽離子對(duì)MPH活性的影響，分別測(cè)定不同KCl及NaCl濃度下MPH的催化活性。如圖1所示，隨著KCl濃度提高至2 mol/L，MPH活性迅速提高；KCl濃度達(dá)到3 mol/L時(shí)，MPH活力較無(wú)KCl時(shí)提高13.39倍。然而，增加NaCl濃度并未能使MPH活性明顯提高。上述結(jié)果表明，K+能促進(jìn)MPH的催化反應(yīng)。

圖1 鹽離子對(duì)MPH酶活的影響

2.2 MPH氨基酸殘基臨近區(qū)域K+分布概率的預(yù)測(cè)

2.2.1 K+分布概率計(jì)算方法的建立

為分析K+與MPH的相互作用，對(duì)兩者混合體系進(jìn)行MD分析預(yù)測(cè)K+與MPH可能的作用位點(diǎn)。為防止K+初始位置對(duì)MD分析結(jié)果的影響，分別將K+和MPH置于溶劑盒子外圍和中央。在300 K下運(yùn)行MD，6 000 ps 后RMSD趨于平緩，此時(shí)K+已分布于整個(gè)溶劑盒子，MD體系達(dá)到平衡。繼續(xù)運(yùn)行20 ns，每2 ps 取1次樣，即共10 000次取樣。在MD分析過(guò)程中，以MPH某原子為中心的圓形區(qū)域(半徑為R)出現(xiàn)K+的幀數(shù)與總幀數(shù)的比值定義為原子臨近區(qū)域K+分布概率，氨基酸殘基中原子臨近區(qū)域K+分布概率的最大值則定義為該氨基酸臨近區(qū)域K+分布概率。

上述離子分布概率的預(yù)測(cè)方法可用于表征K+與MPH氨基酸殘基的相互作用，但MPH原子鄰近區(qū)域半徑和K+隨機(jī)運(yùn)動(dòng)會(huì)影響預(yù)測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

2.2.2 MPH原子鄰近區(qū)域半徑對(duì)K+分布概率預(yù)測(cè)的影響

氨基酸殘基僅能與一定范圍的K+產(chǎn)生有效的相互作用，設(shè)定過(guò)大的MPH原子鄰近區(qū)域半徑會(huì)引入氨基酸與離子相互作用之外的噪音。因此，分別計(jì)算3、4、 5 ? K+在氨基酸殘基附近的分布概率。不同的分布半徑顯示了一致的K+分布規(guī)律。MPH原子鄰近區(qū)域半徑越大，MPH原子鄰近區(qū)域K+分布概率越大，但同時(shí)引入了大量噪音(圖2)。因此，選擇3 ?作為MPH原子鄰近區(qū)域半徑。

a-3?；b-4?；c-5?

2.2.3 水溶劑主體中K+隨機(jī)運(yùn)動(dòng)對(duì)K+分布概率預(yù)測(cè)的影響

K+在水溶劑主體中的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)和初始位置可能影響MPH氨基酸殘臨近區(qū)域K+分布概率預(yù)測(cè)。為消除初始位置對(duì)計(jì)算結(jié)果的影響，在運(yùn)行MD前使K+遠(yuǎn)離MPH。MD分析顯示，K+隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的平均RMSF為60 ?(圖3)，遠(yuǎn)大于而溶劑盒子的半徑10 ?。上述結(jié)果，在20 ns分析范圍內(nèi)，設(shè)定的MD分析體系中各區(qū)域K+與MPH具有同等的接觸機(jī)會(huì)。

圖3 K+在水溶劑中的RMSF分析

2.2.4 MPH氨基酸殘基臨近區(qū)域K+隨機(jī)運(yùn)動(dòng)對(duì)K+分布概率預(yù)測(cè)的影響

基于酶學(xué)分析的結(jié)果，K+通過(guò)與特定氨基酸殘的相互作用來(lái)改變酶的催化特性。然而，K+遷移至MPH氨基酸殘基臨近區(qū)域時(shí)，其隨機(jī)運(yùn)動(dòng)有干擾K+分布概率預(yù)測(cè)的可能。參照蛋白質(zhì)分子中“氫鍵壽命”，定義了氨基酸臨近區(qū)域K+壽命(MPH氨基酸殘基臨近區(qū)域K+連續(xù)出現(xiàn)的幀數(shù)所對(duì)應(yīng)的時(shí)間)。MD分析顯示，氨基酸殘基臨近區(qū)域中單個(gè)K+最長(zhǎng)壽命與該區(qū)域內(nèi)總體K+最長(zhǎng)壽命基本一致(圖4)。因此，MPH氨基酸殘基臨近區(qū)域K+隨機(jī)運(yùn)動(dòng)對(duì)K+分布概率預(yù)測(cè)的影響不明顯。

a-單個(gè)K+；b-總體k+

2.3 K+與MPH關(guān)鍵作用位點(diǎn)分析

MPH與1 mol/L K+的MD分析顯示，臨近區(qū)域K+分布概率大于5%的原子數(shù)僅占MPH總原子數(shù)的1.19%(圖5-a)。這表明MPH中絕大部分K+分布概率較低。故分析統(tǒng)計(jì)臨近區(qū)域K+分布概率大于5%的氨基酸殘基數(shù)量，以確定K+作用的氨基酸偏好性。分析結(jié)果顯示，臨近區(qū)域K+分布概率大于5%的氨基酸殘基數(shù)量最多的是Asp，其次是Glu、Gln和Asn(圖5-b)。這說(shuō)明K+主要偏好酸性氨基酸，其次偏好于酰胺類(lèi)氨基酸。

a-高于某分布概率原子的占比；b-氨基酸殘基對(duì)K+的偏好性

為考察K+對(duì)MPH蛋白結(jié)構(gòu)的影響，通過(guò)MD分析了MPH結(jié)構(gòu)柔性值RMSF。結(jié)果顯示，相對(duì)于無(wú)K+條件下，1 mol/L K+顯著降低了MPH 中A85-T95與V323-N329的RMSF，表明2個(gè)區(qū)域柔性明顯下降(圖6-a)。在A85-T95中，臨近區(qū)域K+分布概率大于5%的氨基酸殘基為 K90(0.061 8)、P92(0.057 4)、E94(0.1250)。其中，K90與P92臨近區(qū)域K+分布概率主要受E94影響，故后者可能是該區(qū)域內(nèi)與K+作用的關(guān)鍵氨基酸。在V323-N329，臨近區(qū)域K+分布概率大于5%的氨基酸殘基分別為S326(0.208 5)、V327(0.254)、N329(0.181)。其中，S326與V327臨近區(qū)域K+分布概率主要受N329影響，故后者可能是該區(qū)域內(nèi)與K+作用的關(guān)鍵氨基酸。

a-MPH氨基酸殘基；b-MPH突變體

通過(guò)丙氨酸取代，進(jìn)一步驗(yàn)證E94與N329對(duì)K+作用的影響。與野生酶相比，E94A與N329A的相對(duì)酶活(1 mol/L K+/0 mol/L K+溶液)分別降低26%與33%，組合變體 E94A/N329A的降低53%(圖6-b)。上述結(jié)果表明，E94與N329是K+調(diào)控MPH催化活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。

3 結(jié)論

鹽離子是影響酶催化性能的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，K+濃度對(duì)Pseudomonassp. WBC-3 MPH催化活性有重要影響。基于MPH進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)分析，建立了MPH氨基酸殘基臨近區(qū)域K+分布概率的預(yù)測(cè)方法。在1 mol/L K+溶液中，K+傾向分布于MPH的Asp、Glu、Gln及Asn殘基附近，并降低了A85-T95與V323-N329的柔性。將A85-T95與V323-N329柔性變化最大的E94與N329分別突變?yōu)锳la，使MPH相對(duì)催化活性(1 mol/L K+溶液/0 mol/L K+溶液)分別較野生酶降低26%與33%，兩者同時(shí)突變?yōu)锳la，其相對(duì)活性降低53%。因此，K+可能通過(guò)與E94、N329相互作用來(lái)調(diào)控MPH催化，為其催化活性的分子改造提供了靶點(diǎn)。研究結(jié)果也為其它酶受鹽離子調(diào)控的機(jī)制及確定改造靶點(diǎn)提供參考。