脂肪干細胞來源外泌體攜帶miR-27抑制白色脂肪的棕色化

鐘瓊慧，黃波，盧婉，徐顏美，閔清華，李書琪，姜鈺環，林晉△，王小中△

肥胖及其相關疾病的發病率逐年上升，成為全球不可忽視的一大問題。白色脂肪組織（white adi?pose tissue，WAT）的過度聚集是導致肥胖的直接原因之一［1］。WAT 與棕色脂肪組織（brown adipose tis?sue，BAT）是共同存在于哺乳動物體內的2種脂肪組織，前者通常以三酰甘油的形式儲存能量，而后者則通過解偶聯蛋白1（uncoupling protein 1，UCP 1）介導的非寒戰形式產生熱量［2］。研究發現，WAT 可以向BAT轉換，拮抗肥胖的產生，這種轉變稱為白色脂肪棕色化，在這過程中過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）、含PR結構域的鋅指蛋白16（positive reg?ulatory domain zinc finger protein 16，PRDM16）及過氧化物酶體增殖子激活受體γ 共激活因子1α（per?oxisome proliferators-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）是最核心的調控因子［3-4］。外泌體作為一種存在于機體幾乎所有微環境中的新興的功能性物質，能夠通過攜帶蛋白質、信使核糖核酸（messen?ger ribonucleic acid，mRNA）、微小核糖核酸（microribonucleic acid，miRNA）等生物活性分子釋放到微環境中，充當細胞間信息交流的中介，參與調節多種細胞生物學功能［5］。本研究旨在探討脂肪干細胞來源的外泌體通過攜帶高濃度miR-27 抑制白色脂肪棕色化的作用機制，以期為肥胖的研究及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性Balb/C小鼠3只，體質量18.6～20.1 g，4周齡，由湖北省動物研究中心提供，用于分離培養脂肪干細胞（ASC）；SPF 級雄性C57BL/6 小鼠18 只，體質量14.9～17.6 g，購自江西中醫藥大學實驗動物中心，3周齡，用于構建肥胖模型及后期實驗。飼養環境均為溫度22～26 ℃，相對濕度50%～60%，人工光照明暗各12 h。人胚腎細胞系293T 細胞株，購自中國科學院細胞庫。低糖DMEM培養基（Hyclone公司），Ⅰ型膠原酶（Gibco 公司），多聚賴氨酸（Sigma 公司），流式檢測抗體CD34、CD45、CD105、CD133及Sca-1（eBioscience公司），質粒提取試劑盒（OMEGE 公司），T4 DNA 連接酶（TAKARA 公司），內切酶BamHⅠ、內切酶XbaⅠ（NEB 公司），Lipofectamine2000 轉染試劑盒（Invitrogen 公司），Western blot 抗 體 UCP1、PPARγ、PRDM16 及 PGC-1α（Bioswamp公司），倒置熒光顯微鏡（Leica公司），流式細胞儀（艾森公司），實時熒光定量核酸擴增（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀、水平電泳設備、凝膠成像系統（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 脂肪干細胞的分離培養及鑒定 SPF級雄性Balb/C小鼠3只,普通飲食，不經特殊處理，斷頸處死小鼠，于75%乙醇中浸泡15 min，無菌條件下分離雙側腹股溝脂肪組織。將收集的脂肪組織剪碎后置于50 mL的離心管內，加入適量的氯霉素，15 min 后用2～3 倍體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次。1 000 r/min 離心5 min 后棄上清，加入5 倍體積的0.1%膠原酶NB4，將離心管置于37 ℃恒溫汽浴搖床內消化2 h，150目無菌網篩濾去未被消化的殘余組織。接著1 000 r/min離心5 min 棄上清，細胞沉淀用PBS 洗滌2 次，將收集的細胞用培養液重懸，以1×105個/cm2的密度接種于培養皿內。置于培養箱中培養，每3 d 換液，待細胞生長達到90%融合時，消化傳代。收集第3代細胞進行形態、表型的鑒定：倒置相差顯微鏡下（×40、×100、×200）觀察細胞的生長及形態學特點；用流式細胞儀檢測細胞CD34、CD45、CD105、CD133 及Sca-1抗原的表達。

1.2.2 外泌體的提取與鑒定 取第3 代ASC 細胞用低糖DMEM 培養液于5%CO2、37 ℃飽和濕度溫箱中進行擴增培養，所用胎牛血清在使用前均經110 000×g超高速離心18 h以去除可能存在于血清中的外泌體。收集120 mL細胞培養24 h后的培養液，依照差次梯度超高速離心法提取外泌體［6］。提取的外泌體用PBS溶液重懸后于-80 ℃保存備用。外泌體的鑒定包括透射電子顯微鏡觀察外泌體形態以及Western blot 技術檢測外泌體標志蛋白Alix 和TSG101 的表達（重復3次上樣）。

1.2.3 過表達miR-27載體的構建 目的基因序列通過基因合成的方法獲取，將合成的DNA 片段及載體分別用內切酶BamHⅠ、內切酶XbaⅠ于37 ℃雙酶切3 h；雙酶切后目的基因片段與載體進行連接，16 ℃連接過夜，待長出菌落，挑取單個菌落，搖菌提取質粒DNA。取對數生長期的293T細胞，以含10%血清的培養基調整細胞密度為1.0×106個/mL，37 ℃、5%CO2培養箱內培養，24 h 待細胞密度達70%～80%時即可用于轉染。轉染24 h 后更換培養基，48 h 和72 h 分別2 次收集病毒上清，收集后以0.45 μm濾器過濾，上清液加濃縮試劑（慢病毒液體積∶濃縮試劑體積=5∶1）4 ℃孵育過夜。完成孵育后，混合液于50 mL 超速離心管中4 ℃、3 500×g離心25 min。棄去上清，根據收集的慢病毒上清液體積，1/100～1/10體積的PBS重懸病毒沉淀，分裝后置于-80 ℃保存備用。

1.2.4 熒光顯微鏡驗證轉染效率及qRT-PCR 驗證miR-27表達量 慢病毒上清感染293T細胞，分為3組：對照組（不進行感染）、空載體組（加入空載體）及慢病毒過表達組（加入構建的過表達miR-27載體），48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，以轉染效率最好的病毒液濃度作為最佳的病毒轉染滴度，計算病毒滴度=病毒顆粒數/病毒原液量。培養生長良好的ASC 細胞24 h 后，取病毒液以最佳滴度感染ASC，培養48 h后收集培養液，提取獲得過表達miR-27的外泌體。提取總RNA，利用qRT-PCR 檢測miR-27 的表達量。按表1 序列進行引物構建，反應過程：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，39個循環；72 ℃延伸7 min。

Tab.1 Primer sequences of miR-27 and internal reference U6表1 miR-27及內參U6的引物序列

1.2.5 動物實驗 C57BL/6 小鼠18 只在適宜的環境中普通喂食。適應7 d后，每2 d以含45%脂肪飼料喂食。喂養8周構建肥胖小鼠模型，并記錄體質量，以肥胖度大于＞20%為造模成功［7］。將肥胖小鼠隨機均分為3組，每組6只：通過尾靜脈分別注射過表達miR-27 ASC 細胞分泌的外泌體（過表達組）、正常ASC 細胞外泌體（正常表達組）及生理鹽水（對照組），每2 d注射1次，共12 d；這期間3組繼續以高脂肪喂食6 d記錄體質量，第7 d開始予以普通喂食，并且每天給予寒冷刺激1 h。第12 天記錄體質量后，分離小鼠附睪皮下脂肪組織（即WAT）和肩胛骨脂肪組織（即BAT），檢測UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α的表達情況。

1.2.6 Western blot 檢測UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α 的表達 配制12%的分離膠、5%的濃縮膠。每孔上樣量為20 μg 蛋白。電泳：80 V 40 min，120 V 50 min，當染料到達膠底部時即終止電泳，260 mA轉膜120 min（轉膜前將膜在甲醇中浸泡5 min）；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗室溫孵育1 h或4 ℃孵育過夜；洗滌3次，每次5 min。隨后根據用量，按照1∶10 000 稀釋二抗，與膜室溫孵育1 h，洗滌3 次，每次5 min。之后進行ECL化學發光檢測，通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 24.0統計學軟件分析數據。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析和重復測量的方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ASC細胞的形態觀察與鑒定 ASC剛貼壁的細胞呈圓形，培養24 h后細胞呈長梭形；培養第3代的ASC 的形態，見圖1。流式細胞儀檢測顯示，CD34、CD45、CD133 低表達，陽性率分別為6.43%、6.35%、0.09%；CD105 與 Sca-1 高表達，陽性率為 93.71%、92.62%，見圖2。

2.2 外泌體的鑒定 分離的外泌體透射電鏡下呈囊泡狀，大小為30～120 nm，見圖3A；Western blot 檢測示，提取物表達外泌體標志蛋白Alix 和TSG101，見圖3B；qRT-PCR 檢測示，脂肪干細胞（5.65±0.78）及脂肪干細胞外泌體（5.26±0.67）中miR-27 表達量高于白色脂肪組織（1.00±0.02），差異有統計學意義（n=3，F=56.661，P＜0.001）。

2.3 miR-27轉染效率 慢病毒轉染293T細胞48 h后，當病毒滴度為5×108TU/mL 時，光學顯微鏡下顯示細胞生長良好（圖4A、B、C），熒光顯微鏡下顯示慢病毒密度高（圖4D、E），以此滴度為病毒最佳轉染滴度。轉染ASC 細胞后的對照組、空載體組及過表達組的 miR-27 的表達量分別為（1.00±0.02）、（1.02±0.02）、（39.68±0.31），差異有統計學意義（n=3，F=44 357.091，P＜0.001）。

2.4 外泌體攜帶miR-27對小鼠體質量與脂肪組織體積的影響 過表達miR-27 對小鼠的體質量變化無明顯影響，相同時點3 組間的體質量組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。3組干預后12 d的小鼠體質量與干預前的體質量的減少量分別為：對照組（3.32±1.36）g、過表達組（1.12±0.43）g、正常表達組（1.75±0.31）g，組間差異有統計學意義（F=10.878，P＜0.01）。相對于對照組，過表達組與正常表達組小鼠分離的WAT 體積要大，且過表達組更明顯；而BAT的大小變化不明顯，見圖5。

Tab.2 Changes in body weights of three groups of mice表2 各組小鼠體質量變化情況 （g，）

Tab.2 Changes in body weights of three groups of mice表2 各組小鼠體質量變化情況 （g，）

F時間=69.108，F交互=7.370，P＜0.05；F組間=0.628，P＞0.05

組別對照組過表達組正常表達組n6 6 6干預前30.82±2.44 29.93±3.02 31.48±3.25注射后6 d 29.60±2.00 29.25±2.49 31.03±3.25注射后12 d 27.50±1.35 28.82±2.80 29.73±3.30

2.5 外泌體攜帶miR-27對UCP1、PPARγ、PRDM16及PGC-1α 的影響 對照組、正常表達組與過表達組的UCP1、PPARγ、PRDM16及PGC-1α相對表達水平呈依次降低趨勢（P＜0.05），見表3、圖6。

Tab.3 Comparison of expression levels of UCP1,PPARγ,PRDM16 and PGC-1α between the three groups表3 各組小鼠中UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α的表達水平比較 （n=3，）

Tab.3 Comparison of expression levels of UCP1,PPARγ,PRDM16 and PGC-1α between the three groups表3 各組小鼠中UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α的表達水平比較 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與對照組比較，b 與正常表達組比較，P＜0.05

組別對照組正常表達組過表達組F UCP1 0.61±0.01 0.59±0.01a 0.30±0.02ab 663.946＊＊PPARγ 0.77±0.02 0.66±0.01a 0.35±0.02ab 535.571＊＊PRDM16 0.37±0.02 0.33±0.01a 0.23±0.01ab 75.941＊＊PGC-1α 0.50±0.01 0.38±0.01a 0.26±0.01ab 534.125＊＊

3 討論

WAT被認為是一種復雜的內分泌器官，通過產生多種脂源性細胞因子調節復雜的生理過程，維持系統能量平衡［8］。BAT主要生理學功能是產生和釋放熱量，對維持機體能量平衡也有重要作用［9］。ASC來源的外泌體內含大量的遺傳信息，通過自分泌或旁分泌的方式對鄰近或遠處的靶細胞發揮其調控作用［10］。因此，如何調控外泌體的產量及控制其攜帶的遺傳信息對WAT的影響，對于理解白色脂肪棕色化的進程及肥胖控制有至關重要的意義。

miRNA 可以從供體細胞傳遞到遠端的受體細胞，以內分泌或旁分泌的方式向特異靶組織細胞傳遞調節信號，改變靶組織某些基因的表達，因此其可以作為疾病診斷的生物標志物［11］。筆者團隊前期也證實了ASC 富含微囊泡（包括外泌體），且攜帶豐富的miRNA，具有促進血管生成、腫瘤發展的生物學作用［6］。有研究表明miR-27 在抗腫瘤方面的作用也不可小覷，包括誘導食管癌、肝癌、胃癌、胰腺癌細胞凋亡［12］，抑制肺癌細胞增殖［13］，參與前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤的疾病進展等，這提示miR-27 可能成為治療或預防腫瘤的靶標，而ASC 來源的外泌體可能成為未來攻克腫瘤難題的新方向。

研究顯示，miR-27 可以直接抑制PPARγ 基因，影 響 線 粒 體 功 能［14］；miR-27 通 過 靶 向 調 節PRDM16，進而參與脂肪棕色化調控［15］。同時有研究發現miR-27a/PPARγ/β-catenin 軸激活也可促進糖尿病腎病的發展，主要是引起足細胞損傷，使血流動力學因子改變，刺激系膜細胞胞外基質的合成增加［16］。在脂肪細胞分化過程中，miR-27能夠直接靶向結合抗增殖蛋白（prohibitin，PHB），引起線粒體結構變化及功能障礙，從而抑制脂肪細胞的分化［17］。由此可見，miR-27可以在多位點參與調控脂肪代謝過程，具有調控白色脂肪棕色化的潛能。但關于外泌體這一具有生物傳導的活性物質，卻鮮有研究其中的miR-27 的含量及其對脂肪組織轉化、代謝的作用。

研究顯示，肥胖狀態下血清中升高的miR-27主要來源于脂肪細胞分泌［18］，且通常作為一種負向調控因子來抑制脂肪細胞分化［19］。本研究結果顯示，ASC 及其外泌體中的miR-27 顯著高于WAT，證實ASC 可能是研究miR-27 功能與機制的良好材料來源。另有研究認為，肥胖小鼠中的WAT 中miR-27含量下降，而體循環中miR-27 則呈現上調趨勢［18］。本研究同樣發現此種現象，這可能與脂肪干細胞分泌外泌體并攜帶miR-27進入體循環有關，進而影響或調控脂肪的代謝。以往研究發現，miR-27主要靶向PPARγ 的表達來抑制脂肪沉積［20］。而本研究發現，miR-27 可以抑制PPARγ 的表達，但主效應是抑制白色脂肪向棕色脂肪轉變，使得白色脂肪消耗減少，呈現出肥胖小鼠體質量下降緩慢。小鼠WAT體積增大，這可能與miR-27 對其他棕色化相關蛋白（UCP1、PRDM16、PGC-1α）的抑制作用更強有關，對BAT合成的抑制作用強于WAT的消耗。

綜上所述，miR-27能夠由ASC以外泌體形式分泌，且能夠被脂肪細胞所攝??；ASC以外泌體形式分泌的miR-27能夠抑制白色脂肪棕色化，該抑制作用主要通過轉運miR-27 下調UCP1、PPARγ、PRDM16及PGC-1α棕色化相關蛋白的表達完成。