TLR4調控自噬與腎臟疾病的研究進展

易揚，謝愷慶

據估計，全世界有8.5 億人因各種原因罹患腎臟疾病，該病作為一個世界性的公共衛生問題越來越受到關注。隨著經濟的快速增長和生活方式的逐步改變，中國面臨著日益加重的腎臟疾病的負擔［1］。有研究表明，炎癥在腎臟疾病的發生發展中起關鍵作用，腎臟固有細胞急性損傷后所誘發的炎癥瀑布是急性腎損傷加重的主要原因，而腎臟細胞慢性損傷所觸發的慢性炎癥導致腎間質過度纖維化是腎功能進行性惡化的主要原因［2］。Toll 樣受體 4（Tolllike receptor 4，TLR4）被內源性或者外源性配體激活后可誘導炎癥的產生，同時也可引起胞漿微管相關蛋白1 輕鏈3（LC3）的聚集（自噬體形成的標志）；TLR4 激活自噬受髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）或含 TIR 結構域的轉接蛋白（TIR-domain-containing adaptor protein including IFN-β，TRIF）與 Beclin1（自噬早期標志物）相互作用所調控［3-4］。有研究顯示，TLR4 調控的自噬參與包括脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）所致腎損傷、腎缺血性再灌注損傷、糖尿病腎病、順鉑所致腎損傷、乙肝所致腎損傷等多種腎臟疾病的發生發展［5-6］。因此深入探索腎臟疾病的自噬調控機制，尋找治療或者延緩腎臟疾病進展的方法具有重要意義。本文將從TLR4 介導自噬異常與腎臟疾病的研究進展做一綜述。

1 自噬

自噬現象是20 世紀60 年代科學家Ashford 和Porter 用電子顯微鏡在人的肝細胞中首次被發現［7］。自噬及自噬異常相關疾病的機制是目前醫學界的研究熱點。自噬與神經退行性疾病、癌癥、感染和炎性腸病等多種疾病的發病機制密切相關［8-10］。自噬主要分為起始、囊泡成核、延伸和融合3 個階段。自噬的起始ULK1/ATG1 復合物（自噬啟動復合物），其哺乳動物同源蛋白命名為ULK1，在酵母中命名為自噬相關基因1（ATG1）。ATG6（哺乳動物同源蛋白命名為Beclin1）的復合物是細胞自噬過程中最重要的正性調節因子，也是自噬小泡成核所必需的，Beclin1及其上下游信號調節蛋白組成重要的自噬調節通路。Beclin1 調節細胞自噬主要通過BH3 結構域與Bcl-2 基因的相互作用來實現。在自噬小泡核化的初級階段激活Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）需要依賴于多蛋白復合物的形成；在成核后吞噬受損的細胞器與大分子物質形成自噬體，稱為自噬小體（autophagosome），完整的自噬小體沿著微管轉運，將其內容物傳遞到溶酶體內降解形成自噬溶酶體。隨后，溶酶體酶降解自噬體的內容物可以用于合成新的蛋白質、細胞器及能量。

2 TLR4信號通路

TLR4 是最早被發現在人類細胞表面的TLRs蛋白，1997 年被 Medzhitov 等［11］首次發現，在先天性免疫應答中扮演著不可或缺的角色。TLR4 可特異性識別來源于細菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原相關分子模式（PAMPs），也可識別來源于腫瘤、壞死或凋亡的細胞釋放的內源性損傷相關分子模式（DAMPs），并與之結合，進而激活TLR 信號轉導通路誘發相關炎癥級聯反應。TLR4 和骨髓分化因子2 作為共同受體來識別其配體，并與配體相結合后激活 TLR4/CD14/MD2 復合物，活化的TLR4 胞內TLR 樣結構域與MyD88 的羧基端結合，繼而激活腫瘤壞死因子受體相關分子6 和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），然后在早期激活核轉錄因子-κB（NF-κB），促進細胞因子的表達和炎癥反應的產生；或者TLR4 通過 TRIF/TICAM-1 和 TRIF/TICAM-2 激活晚期的NF-κB，同時激活TRIF-TBK/IRF3 信號通路引起Ⅰ型干擾素的釋放，以及誘發免疫系統的調控性應答［12-13］。TLR4 既可以激活依賴性 MyD88 信號通路，也可激活TRIF 信號通路，依賴/非依賴性途徑最終均可活化NF-κB 和MAPK 信號通路，誘導炎性因子的表達，進而促進抗病毒及抗細菌免疫。

3 TLR4信號通路調控自噬

3.1 TLR4 調控自噬 早期研究將自噬與天然免疫聯系起來，認為這是宿主對多種細胞內病原體的防御反應［14］。在感染過程中自噬的調控過程是復雜的，由許多受體介導，TLR4 可識別病原體的特定分子模式，在天然免疫和適應性免疫中起著重要作用，是第1 個被證明參與自噬過程的受體。自噬是一種細胞對饑餓的反應，可以將受損的細胞器和長壽的蛋白質從細胞質運送到溶酶體來清除。然而，多種免疫和炎癥信號通過TLR4 介導自噬異常［15］，若誘發自噬增強不足或被抑制則引起宿主細胞自我保護作用削弱，致細胞受損及觸發炎癥反應；若誘發自噬過度增強則觸發宿主細胞凋亡。有研究表明TLR4的信號轉導誘導炎癥產生的同時也誘導細胞的自噬小體形成明顯增多［16-17］。

3.2 TLR4-MyD88 的信號通路調控自噬 TLR4 下游通路蛋白 MyD88 直接或間接將Beclin1 引入TLR4 信號復合物中，可減少Beclin1 和Bcl-2 之間的相互作用，誘導Beclin1 的泛素化，導致Bcl-2 釋放Beclin1 啟動自噬體的形成。TRAF6 可激活NF-κB 從而誘導炎性因子的產生，是TLR4-MyD88 信號通路中的關鍵分子。通過招募Beclin1 并誘導Beclin1 的泛素化后可激活自噬。磷酸化的UNC-51樣激酶 1（UNC-51-like kinase 1，ULK1）一直以來被認為是自噬的一個關鍵調控因子，自噬溶酶體組裝前，自噬信號是通過由 mAtg13、FIP200（酵母中Atg17 的同系物）、ULK1（酵母中 Atg1 的同系物）3種蛋白形成的ULK1 復合物的活化介導的。在體內ULK1 復合物是連接上游營養或能量感受器雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）與下游自噬體形成的橋梁，泛素化TRAF6也可激活ULK1 而促進自噬。近期研究表明，在七氟醚治療老年大鼠模型中，雷帕霉素可通過TLR4-MyD88 信號通路減輕腦組織損傷和激活自噬的產生［18］。

3.3 TLR4-TRIF 信號通路調控自噬 細菌感染會引發自噬和炎癥的激活，相關研究已經證明，銅綠假單胞菌感染可通過TLR4-TRIF 信號通路激活自噬［19］。朊病毒病是一種神經退行性疾病，其特征是朊蛋白的錯誤折疊、腦內海綿狀改變以及小膠質細胞廣泛激活引起的腦炎癥。NALP3 炎癥小體是一種多蛋白復合物，是先天免疫系統的組成部分，可以調控細胞釋放促炎細胞因子。Lai 等［20］在首次探討朊病毒病中炎癥與自噬的相互調節作用時，發現自噬可抑制經朊蛋白片段106-126（PrP106-126）處理的小膠質細胞中NALP3 炎癥小體的激活，同時也抑制隨后的 caspase-1 裂解和白細胞介素（IL）-1β 的釋放，而NALP3 炎癥小體通過激活caspase-1 裂解TRIF 限制自噬。TLR4 或 TRIF 基因敲除抑制PrP106-126 誘導小膠質細胞中的自噬，提示TLR4-TRIF 信號通路參與PrP106-126 誘導的自噬。自噬和炎癥反應之間的關系在創傷性腦損傷（TBI）后繼發性腦損傷中起著重要作用。在大鼠TBI 模型中，TAK-242 可顯著降低 TBI 誘導 TLR4、Beclin1 和LC3-Ⅱ的表達水平，并維持24 h 內P62 表達水平無明顯變化。通過蛋白質印跡分析表示，TLR4 下游信號分子 TRIF、NF-κB、腫瘤壞死因子（TNF）-α 和IL-1β 在海馬組織中的表達顯著下調。有研究表明，TLR4/TRIF 信號通路可參與調控海馬神經元自噬［3］。Gao 等［21］研究發現 TLR3 基因的敲除可通過TLR3-TRIF 抑制自噬，減輕小鼠心肌梗死面積，減輕心力衰竭并改善生存率［21］。

3.4 NF-κB 調控自噬 NF-κB 被認為是調控炎癥相關基因誘導的主要轉錄因子，在細胞增殖、免疫應答、應激反應、炎癥和凋亡等多種細胞活動中發揮重要作用。在人類中，至少有5 名NF-κB 家族成員，包括 NF-κB2（P52）、NF-κB1（P50）、RelB（relb 原癌基因，NF-κB 亞基）、c-rel（relto-原癌基因，NF-κB亞基）和 rela（rela-原癌基因，NF-κB 亞基，P65）［22］。NF-κB 介導的炎癥與自噬之間相互作用、相互依賴［23-24］。NF-κB 活化可以抑制細胞自噬水平。TRAF6 作為NF-κB 信號轉導通路中的信號轉導元件，可被TLR4 激活而產生，也可誘導自噬關鍵蛋白Beclin1 泛素化。然而，Beclin1 泛素化被一種NF-κB 抑制劑 A20 所抑制，導致自噬被抑制［25］。腫瘤壞死因子激活的NF-κB 通過激活mTOR 和抑制活性氧的積累，從而抑制自噬的發生［26］。然而，在另一些情況下，NF-κB 活性又可以增強細胞自噬水平。在熱休克后的恢復期內，NF-κB 轉錄因子被激活，可以通過調節自噬體的成熟誘導自噬，對熱休克后的細胞存活有至關重要的作用。NF-κB 與Beclin1基因啟動子上的NF-κB 的結合位點結合，從而激活自噬的產生［23］。

4 TLR4調控自噬與腎臟疾病的關系

4.1 LPS 所致腎損傷 膿毒癥相關的急性腎損傷（acutekidney injury，AKI）最常見的致病因素是膿毒癥。在成人和兒童的研究數據中，膿毒癥占發達國家所有AKI 的26%～50%，而在原發性腎臟疾病相關的 AKI 中占 7%～10%［27］。LPS 是革蘭陰性膿毒癥時釋放的一種免疫原性細菌細胞壁成分，TLR4 是LPS 的主要受體。Leventhal 等［28］通過腹腔注射 LPS建立化膿性AKI 小鼠模型，結果顯示，TLR4 基因缺失的 C57BL/10SCN 小鼠注射 LPS（15 mg/kg）24 h后，腎皮質LC3-Ⅱ積累與對照組（注射生理鹽水）無明顯差異。分離原代腎皮質的腎小管上皮細胞，并將其在合適的培養基中培養24 h 后，進一步證實TLR4 在LPS 誘導腎小管上皮細胞自噬的作用。該研究表明，LPS 不能誘導來自C57BL/10SCN 小鼠的腎小管上皮細胞自噬；首次證明LPS 是依賴于TLR4 信號通路誘導人腎小管上皮細胞的自噬。該研究還采用腎小管特異性自噬蛋白7（ATG7）基因缺失的小鼠模型，確定了自噬對LPS 誘導的AKI 的腎小管具有保護作用，從而確定自噬是防治膿毒性AKI 的新靶點。Zhao 等［29］研究顯示，LPS 可通過TLR4-MyD88 途徑誘導巨噬細胞中炎性因子TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的表達上調；同時顯著提高 LC3B和Beclin1 的表達水平；且研究表明熊果酸（UA）可通過TLR4/MyD88 途徑增強巨噬細胞自噬從而預防LPS 導致的腎損傷。

4.2 腎缺血再灌注損傷 缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是造成 AKI 第二大原因，常見于各種原因導致的失血、休克、器官移植等過程中。IRI 所致的腎損傷能夠造成組織器官發生不可逆的損傷，包括血管內皮細胞功能障礙、炎癥和腎小管細胞損傷［30］。TLR4 在腎臟組織中高表達，并且還可通過TLR4-MyD88 信號通路參與腎IRI 的過程［31］。Poluzzi 等［32］研究顯示，腎 IRI 小鼠在 IRI發作時，TLR4 缺乏和CD44 缺乏小鼠巨噬細胞中Biglycan（富含小亮氨酸的雙糖鏈蛋白聚糖）所誘導的LC3-Ⅱ、P62 表達水平被顯著抑制。共聚焦顯微鏡下可見TLR4 缺乏和CD44 缺乏小鼠巨噬細胞中自噬水平降低。此研究結果提示Biglycan 可通過TLR4 與CD44 相互作用激活巨噬細胞中的自噬，從而減少腎臟炎癥及損傷。因此TLR4 調控自噬在缺血再灌注所導致的AKI 中具有重要作用，但具體機制有待進一步證實。

4.3 糖尿病腎病 糖尿病腎病是糖尿病全身微血管病變的腎臟表現，也是糖尿病最常見且最影響其預后的慢性并發癥［33］。研究已證實，糖尿病最終發展為終末期腎衰竭的主要原因之一是由糖尿病引起的慢性炎癥反應，而TLR4 激活的信號轉導通路與這種炎癥反應有關［34］。Xu 等［35］在體外采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）處理腎小管上皮細胞模型，抑制TLR4 表達后LC3-Ⅱ表達水平降低，P62 表達水平增高。研究結果提示TLR4 可參與調控ox-LDL誘導腎小管上皮細胞的自噬。Wang 等［36］研究表明，在糖尿病患者腎組織足細胞內基因敲除MyD88 后可下調LC3-Ⅱ的表達，但上調P62 和p-mTOR 的表達，然而敲除TRIF 基因對這些蛋白質的表達無明顯影響。研究結果提示TLR4-MyD88 信號通路參與誘導足細胞自噬。足細胞損傷是糖尿病腎病中腎小球硬化和蛋白尿的主要發病機制。足細胞的基底自噬率在所有腎細胞中最高，因此這種自身修復機制對足細胞來說尤其重要［37］。

4.4 順鉑所致腎損傷模型 順鉑具有明顯的腎毒性，是一種常用的化療藥。大量研究已經證實，順鉑可激活腎小管上皮細胞自噬［38-39］。腎小管上皮是腎損傷的重要靶點，并且對腎毒素和缺血再灌注引起的腎損傷更敏感，更易激活自噬。相關研究表明，TLR4 在順鉑所致腎損傷進展中起著不同的作用。TLR2 和TLR4 在腎臟組織中高度表達，并參與順鉑誘導的 AKI［40］。Shen 等［41］采用順鉑誘導腎損傷小鼠模型，研究結果表明TLR2 可促進PI3K/Akt 磷酸化，增強腎小管上皮細胞的自噬，對順鉑誘導的AKI具有保護作用，而TLR4 在順鉑所致腎損傷進展中起著不同的作用。Andrade-Silva 等［6］采用腹膜內注射順鉑誘導的AKI 小鼠模型，將其分為順鉑組、順鉑+TLR4KO（TLR4 的基因敲除）組、順鉑+TLR2KO（TLR2 的基因敲除）組，順鉑+TLR2KO 組小鼠的自噬相關分子（即LC3 和ATG5）表達水平低于順鉑+TLR4KO 組；與順鉑組相比，缺乏TLR2 會導致嚴重的腎組織損傷，而缺乏TLR4 可防止小鼠腎組織的損傷；研究結果提示TLR4 可通過依賴性MyD88 信號通路及TRIF 信號通路激活自噬；因此在腎損傷時TLR4 可通過TRIF 信號通路產生不同于TLR2激活自噬時的反應。

4.5 乙肝所致腎損傷 我國是乙型肝炎大國，AKI是終末期肝病最常見的并發癥之一［42］。張曉田等［43］研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）感染致腎損傷中也有自噬信號異常激活，采用HBV 感染患者的血清感染人腎小管上皮細胞系，并進行體外培養和TLR4 靶向干預實驗，發現HBV 感染組的LC3-B 和Beclin1 表達水平升高，P62 表達水平降低，提示HBV 感染可激活腎小管上皮細胞的自噬，這可能是一種自我保護機制。進一步研究發現，激活TLR4/NF-κB 信號通路后自噬水平加強，而抑制TLR4/NF-κB 信號通路后自噬水平有所減弱，證明通過靶向干預TLR4 能夠調控HBV 感染腎小管上皮細胞的自噬。

5 結論與展望

自噬是真核細胞中高度保守的細胞生理性活動過程，在生理情況下，自噬參與維持細胞穩態，廣泛參與到多種細胞重要生理過程的調控。腎損傷時，自噬可吞噬破裂的溶酶體以及恢復溶酶體功能，以防止細胞損傷；還可通過抑制炎癥小體的活性，同時清除受損細胞器并對炎癥反應進行調節，以防炎性因子的產生。近年來TLR4 調控自噬與腎臟疾病中的作用已經受到研究者的廣泛關注，但目前其具體機制尚無定論。在不同原因導致的急慢性腎損傷中均有研究報道顯示TLR4 激活自噬對腎損傷發揮保護作用；然而在順鉑導致腎損傷模型中，TLR4 可介導自噬異常從而加劇腎小管損傷并對腎臟功能造成影響。目前在腎臟疾病中TLR4 調控自噬雙重作用尚未完全闡明，涉及的具體信號通路調控機制有待進一步探索。闡明在腎臟疾病中TLR4 調控自噬的發生機制和作用，并加以合理的干預和利用，開發調控自噬的藥物，可為臨床尋找延緩或防治腎臟疾病提供精確的治療靶點。