吸入氫氣對膿毒癥小鼠海馬組織DNA甲基化的影響

于明懂，李佩，于泳浩，盧悅淳，陳會敏，王新，謝克亮

膿毒癥可以造成嚴重的中樞神經系統并發癥，引起嚴重的認知功能障礙，即膿毒癥相關性腦病（sepsis-associated encephalopathy，SAE）。對膿毒癥相關性腦病的機制研究和治療措施是醫學領域的重點。既往研究表明吸入氫氣可以明顯減輕膿毒癥時腦功能損傷，改善認知功能，其機制與抑制氧化應激和炎癥反應有關［1］。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾，在腦組織發生氧化應激和炎癥反應時，DNA 甲基化水平也發生改變，引起嚴重的認知功能障礙［2-4］。改變中樞神經系統的DNA 甲基化狀態，可抑制腦組織的氧化應激和炎癥反應，改善認知功能［5-6］。因此，推測通過調控DNA 甲基化狀態來抑制氧化應激和炎癥反應是氫氣治療膿毒癥相關性腦病的機制之一。本研究擬探討吸入氫氣時膿毒癥小鼠海馬組織的DNA甲基化狀態發生的變化，為氫氣治療膿毒癥相關性腦病研究提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性C57BL/6 小鼠54 只，6～8周齡，體質量20～25 g，均由中國軍事醫學科學院實驗動物中心提供，飼養于自然晝夜交替的通風環境，自由飲水、飲食。采用隨機數字表法分為3 組（均n=18）：假手術組（Sham組）、膿毒癥組（Sepsis組）和氫氣治療組（Sepsis+H2組）。

1.2 主要試劑與儀器 通用型柱式基因組提取試劑盒（北京康為世紀）；全基因組甲基化定量檢測試劑盒（Epigentek 公司，美國）；Trizol試劑（Molecular Research 公司，美國）；cDNA逆轉錄試劑盒（Thermo 公司，美國）；SYBR Green Master Mix試劑盒（Thermo公司，美國）；兔源DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和GAPDH 一抗均購自Abcam 公司（英國）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（Sigma公司，美國）；GCH-500高純氫氣發生器（天津同普分析儀器科技有限公司）；PG610氫氣檢測儀（河南英特電器設備公司）；多功能酶標儀（PerkinElmer公司，美國）；Piko Real96 實時熒光定量PCR 檢測系統（Thermo 公司，美國）。

1.3 膿毒癥模型的制備 采用盲腸結扎穿孔（CLP）法建立小鼠膿毒癥模型［7］，以2%水合氯醛15 mL/kg 腹腔注射麻醉，腹正中線切開，Sepsis組和Sepsis+H2組用手術縫線在回盲瓣下方盲腸近段1/4 處結扎盲腸，用20G 無菌針頭將被結扎盲腸貫穿穿孔，擠出盲腸內容物約0.3 mL，將盲腸及其內容物還納腹腔后縫合腹壁切口。Sham 組不進行盲腸結扎和穿孔，其余操作同上。

1.4 干預和治療 參考文獻［8］的方法，使用GCH-500高純氫氣發生器生成氫氣，將各組小鼠于手術后1 h和6 h放入有進氣口和出氣口的密封樹脂箱子內，采用PG610氫氣檢測儀監測箱內氫氣濃度。Sepsis+H2組吸入用空氣混合的2%氫氣1 h，其他2 組小鼠只置于相同環境中，不吸入氫氣。在手術結束時各組小鼠均于頸部皮下給予生理鹽水5 mL/100 g進行液體治療，腹腔注射頭孢曲松30 mg/kg和克林霉素25 mg/kg，每6 h注射1次，共3 d［9］。于術后1、3、7 d通過頸椎脫臼的方法處死小鼠（每個時點6只），沿腹部正中切口，暴露心臟，在右心耳處用一鈍頭注射器針頭送至主動脈根部，用預配制的4 ℃肝素化生理鹽水進行灌洗，待右心耳處流出清亮液體，表明灌洗充分。迅速斷頭取腦，于冰上分離腦海馬組織，放入液氮冷凍備用。

1.5 全基因組甲基化水平的檢測 每組取6 只小鼠海馬組織，使用通用型柱式基因組提取試劑盒提取海馬組織的基因組總DNA，測定DNA濃度；按照全基因組甲基化定量檢測試劑盒操作步驟，利用多功能酶標儀檢測全基因組甲基化水平。

1.6 PCR 檢測 采用實時定量-PCR（Real-time PCR）法檢測膿毒癥小鼠海馬組織DNA 甲基化轉移酶（DNMTs，包括DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b）的mRNA 水平。每組分別取6只小鼠海馬組織，采用Trizol 試劑提取各組織中RNA，測定RNA 濃度；按照cDNA 逆轉錄試劑盒說明書步驟將mRNA 逆轉錄合成cDNA；使用SYBR Green 法進行模板的實時定量PCR 檢測，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參。實時定量PCR 采用的引物序列見表1。按照SYBR Green Master Mix試劑盒說明書進行操作，采用20 μL體系進行PCR擴增，反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，共40 個循環。用Piko Real 96 實時熒光定量PCR檢測系統進行擴增并分析處理數據。采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

Tab.1 Primer sequence of Real-time-PCR表1 實時定量PCR 引物序列

1.7 Western blot 檢測 DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b 蛋白表達水平 取海馬組織，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑，4 ℃下14 000×g離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白質濃度。加入4×蛋白上樣緩沖液，經凝膠電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，用含吐溫20的磷酸鹽緩沖液（TBST）洗膜 3 次，加入 DNMT1（1∶1 000）、DNMT3a（1∶2 000）、DNMT3b（1∶3 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃ 孵育過夜。TBST洗膜后加入HRP 標記的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，底物化學發光顯影，使用Image J軟件分析灰度值。以目的蛋白與內參GAPDH的灰度值比值作為表達量檢測表達情況。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠全基因組DNA 甲基化水平比較 與Sham組比較，Sepsis 組1、3和7 d時全基因組甲基化水平均明顯降低（P＜0.05），與 Sepsis 組比較，Sepsis+H2組1、3 和7 d 時全基因組甲基化水平均明顯升高（P＜0.05），見圖1。

2.2 各 組 小 鼠 DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b 的mRNA 表達水平 建立模型后 1、3、7 d 時 DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b 的 mRNA 表達水平發生了明顯的 改 變 。 與 Sham 組比較，Sepsis 組 1、3、7 d 時DNMT1 和 DNMT3a 的 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05），DNMT3b 的 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05）；與Sepsis 組比較，Sepsis+H2組1、3、7 d 時DNMT1 和 DNMT3a 的 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05），DNMT3b 的 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05），見圖2。

2.3 各組小鼠海馬組織DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 蛋白表達 與對照組相比，膿毒癥時小鼠海馬組織在1、3、7 d時DNMT1和DNMT3a的表達水平均明顯升高（P＜0.05），DNMT3b 的表達水平明顯降低（P＜0.05）；氫氣治療后，Sepsis+H2組小鼠海馬組織在1、3、7 d時DNMT1和DNMT3a的表達水平比Sepsis 組降低（P＜0.05），DNMT3b 的表達水平較Sepsis組升高（P＜0.05），見圖3、表2。

3 討論

Tab.2 Comparison of the expression levels of DNMT1,DNMT3a and DNMT3b at different time points between three groups表2 各組小鼠海馬組織DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表達的比較 （n=6，）

Tab.2 Comparison of the expression levels of DNMT1,DNMT3a and DNMT3b at different time points between three groups表2 各組小鼠海馬組織DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表達的比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Sepsis組比較，P＜0.05

組別Sham組Sepsis組Sepsis+H2組F DNMT1DNMT3a DNMT3b 1 d 0.14±0.02 0.21±0.03a 0.18±0.04ab 7.66＊＊3 d 0.15±0.03 0.22±0.04a 0.18±0.03ab 6.53＊＊7 d 0.16±0.03 0.24±0.05a 0.19±0.04ab 7.17＊＊1 d 0.12±0.01 0.46±0.07a 0.31±0.05ab 69.68＊＊3 d 0.13±0.02 0.65±0.09a 0.33±0.07ab 92.42＊＊7 d 0.13±0.02 0.68±0.08a 0.36±0.06ab 132.12＊＊1 d 0.18±0.03 0.08±0.02a 0.12±0.02ab 26.82＊＊3 d 0.16±0.02 0.08±0.01a 0.13±0.03ab 21.43＊＊7 d 0.17±0.03 0.07±0.02a 0.12±0.02ab 26.47＊＊

膿毒癥是急危重癥患者死亡的重要原因，SAE是膿毒癥患者的常見并發癥，能夠明顯提高患者病死率［10］，并可造成嚴重的急性和遠期認知功能障礙，嚴重影響患者治愈后的生活質量［11-12］，SAE 的發病機制尚不十分明確，可能與氧化應激、炎癥反應、線粒體和血管功能障礙、神經傳遞障礙和細胞凋亡等有關［13-14］。氫氣是一種還原劑，具有抑制炎癥反應、抗氧化應激、抗凋亡和促進能量代謝等作用［15］，無論是吸入氫氣還是口服或注射富氫水對缺血/再灌注損傷、創傷、膿毒癥、糖尿病、神經系統退行性病變等多種不同動物模型均有保護作用［16-17］。筆者前期動物實驗表明給膿毒癥小鼠吸入2%氫氣可明顯增加Morris 水迷宮實驗中小鼠在目標象限時間的百分比和穿過站臺的次數，改善膿毒癥小鼠的認知功能障礙，對SAE起到治療作用，其機制與氫氣可以減少腦海馬組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等炎癥因子表達水平，增加超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性，降低丙二醛（MDA）和8-異前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）水平等有關，但是否與其他機制有關尚不十分明確［1］。

DNA 甲基化是一種表觀遺傳學修飾，其動態變化貫穿于生命的始終，且對基因組的功能調控和穩定性維持具有重要意義。在中樞神經系統，DNA 甲基化對維持大腦的認知功能起到重要作用，通過基因調控等機制參與了神經突觸可塑性和認知記憶的形成過程［18］，如果DNA 甲基化異常，則可導致中樞神經退行性病變和功能障礙［19-20］。創傷應激時，中樞神經系統的DNA甲基化水平發生改變，通過調控Gdnf、Bdnf、Dlgap2、Gad、Reln 等突觸可塑性相關基因在海馬等區域的表達，影響神經突觸可塑性和記憶能力，造成認知功能障礙［21］。本研究結果顯示膿毒癥小鼠海馬組織全基因組DNA甲基化水平降低，在吸入氫氣后明顯升高，說明在SAE 這種急性腦損傷情況下，DNA 甲基化狀態發生了改變，全基因組甲基化水平降低，吸入氫氣有明顯的改善作用，能夠一定程度上升高全基因組甲基化水平。

DNA的甲基化過程是在DNMTs的催化下，將甲基供體S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）中的甲基轉移到DNA特定堿基上，DNA甲基化可以發生在胞嘧啶的C-5 位、腺嘌呤的N-6 位及鳥嘌呤的N-7位等多個位點，但在高等真核細胞中DNA甲基化主要發生在CpG 中胞嘧啶的C-5 位，使其變為5-甲基胞嘧啶（5mc）。DNMTs 主要包括DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b。DNMT1 在 DNA 復制的過程中，識別母鏈已甲基化的CpG位點，催化相應子鏈上的CpG 位點甲基化，將母鏈的甲基化狀態復制到子鏈中，稱為維持甲基轉移酶，在成熟大腦中，DNMT1主要表達在有絲分裂后的神經元和神經膠質細胞，主要作用是維持局部的甲基化狀態［22］；DNMT3a 和DNMT3b可將雙鏈DNA上未甲基化的CpG位點重新建立新的甲基化狀態，稱為重新甲基轉移酶，中樞神經系統中DNMT3a主要表達在發展、成熟的神經元，以及少突膠質細胞及星形膠質細胞中，對中樞神經系統的復雜行為學功能起到關鍵作用，DNMT3b 則主要表達在胚胎及神經前體細胞，在成熟神經元內表達較少，但對突觸可塑性和記憶形成有一定的調節作用［23］。本研究結果顯示在1、3、7 d 時膿毒癥小鼠海馬組織DNMT1 和DNMT3a 的mRNA 和蛋白表達水平增強，DNMT3b 的表達mRNA 和蛋白表達水平減弱，在吸入氫氣后，DNMT1 和DNMT3a 的表達減弱，DNMT3b的表達增強，說明膿毒癥時小鼠海馬組織內的DNA 甲基化轉移酶的表達發生了明顯的紊亂，并且吸入氫氣可以在一定程度上糾正這些紊亂。因此，筆者推測能夠糾正DNA甲基化的紊亂狀態是氫氣治療SAE的重要機制之一。

正常情況下，DNA 甲基化處于一種相對穩定的狀態，有賴于甲基化和去甲基化過程的動態平衡，去甲基化過程是指在去甲基化酶的作用下移除5mc上的甲基，使其重新變為胞嘧啶的過程［24］。本研究中膿毒癥組小鼠雖然在 1、3、7 d 時 DNMT1 和DNMT3a的mRNA 和蛋白表達均明顯增加，但全基因組DNA甲基化水平卻有不同程度的降低，可能與其他因素影響有關，如甲基供體不足，去甲基化酶活動增強等，然而氫氣能夠糾正膿毒癥小鼠海馬組織DNA甲基化狀態的具體機制還需進一步研究。

綜上所述，吸入氫氣能在一定程度上糾正膿毒癥小鼠海馬組織的DNA甲基化狀態的紊亂，升高全基因組DNA甲基化水平，使DNMT1和DNMT3a的表達增強，DNMT3b 的表達減弱。改善DNA 甲基化紊亂狀態是氫氣治療SAE的重要機制之一。