阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征相關蛋白FNDC5的生物信息學分析*

韓劍星 楊麗華 趙 華 安 穎 馬宇鋒

（山西醫科大學第二醫院口腔科 山西太原 030001）

有研究表明，阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）高度流行于各年齡段人群［1］。該疾病會因睡眠中上氣道阻塞引起呼吸暫停等病征，不僅影響人們的正常睡眠，而且可能因通氣量不足而引起或加重心血管疾病［2］，造成生命危險。目前OSAS 的具體病因尚不明確，人們普遍認為該疾病是由諸如肥胖、炎癥、氣道結構異常、中樞及內分泌因素等綜合因素引起的，而肥胖則被認為是其中風險最高的因素［3］。FNDC5（fibronectin type Ⅲdomain containing 5）也稱鳶尾素（irisin），最早由哺乳動物基因收集（Mammalian Gene Collection，MGC）項目組于2002年報道［4］。2012年，Bostr?m P 等［5］首次 報道了FNDC5 與肥胖的關系。他們的研究表明，血清中的鳶尾素可通過運動進行誘導產生，且血清鳶尾素水平只需輕微地升高便可增加小鼠體內能量的消耗，調節體內葡萄糖穩態的平衡，改善肥胖狀況。該發現經報道后受到人們的廣泛關注，許多研究者將其視為肥胖臨床治療領域的重大突破。

2016年，Yanli Li 等［6］報道了他們對165 名男性OSAS 患者和98 名健康男性受試者血清鳶尾素濃度進行的橫斷面研究。結果顯示，OSAS 患者血清鳶尾素濃度明顯低于對照組，且隨著OSAS患者病情嚴重程度的增加，血清鳶尾素水平顯著降低。研究者首先認為鳶尾素通過抑制肥胖發展，可在OSAS 發病機制中對人體產生保護作用，且該結論有豐富的文獻資料支持。其次，鳶尾素還被認為與炎癥反應有關，可通過降低炎癥因子，進而抑制或恢復多種疾病［7-8］，而且與其具有高度同源性的FNDC4 同樣具有降低炎癥趨化因子的功能［9］，因此，研究者推測，鳶尾素也可通過抗炎作用參與抑制OSAS 的發生或發展。雖然該研究具有一定的局限性，但仍有理由相信，血清鳶尾素水平與OSAS的發生或發展呈負相關。

本文運用一系列生物信息學工具和方法，對OSAS 相關因子FNDC5 的結構、功能、蛋白相互作用等作出預測和分析，以期得到更為深入的FNDC5 的數據和結論，為將來OSAS 發病機制或治療方法等領域的研究提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料FNDC5基因與蛋白質的相關數據由美國國立生物技術信息中心（NCBI）獲得，網址為https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/252995。為使結果更加準確、專一，選取了FNDC5 蛋白的第一亞型進行分析，本文統稱為FNDC5 蛋白。該亞型在NCBI 的定義為FNDC5 protein ［Homo sapiens］，其GenBank 登錄號為AAH62297.1，網址為https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAH62297.1。

1.2 方法 FNDC5 的基本生物學信息由以下途徑獲取：SignalP 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）分析包括分子量、氨基酸比率、不同電性氨基酸數、理論等電點、理論半衰期、不穩定指數、脂肪指數等在內的多種理化性質；Protscale（http://web.expasy.org/protscale/）對該蛋白進行親疏水性分析；ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）對該蛋白的信號肽結構進行預測；TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析該蛋白是否具有跨膜結構。

FNDC5 的組織表達特異性和亞細胞定位等由以下軟件或數據庫分析得到：NCBI 相關數據庫中查找該蛋白的組織表達特異性；PSORT Ⅱ（https://psort.hgc.jp/form2.html）分析該蛋白的亞細胞定位。

FNDC5 的二、三級結構由以下軟件預測：NCBI 相關數據庫分析FNDC5 的保守結構域；SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html） 分析該蛋白的二級 結 構；SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）分析該蛋白的三級結構。

FNDC5 的翻譯后修飾情況由以下軟件預測：NetNGlyc 1.0 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/） 預測FNDC5 的N-糖基化位點；NetOGlyc 4.0 Server （http://www.cbs.dtu.dk/services/Net OGlyc/） 預測O-糖基化位點；Netphos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測磷酸化位點。

FNDC5 的蛋白互作關系由STRING（http://string-db.org/）構建并分析。設置“置信度為0.7，預測所得蛋白數不超過10 個”為條件，進行預測，得到與FNDC5 可產生各類相互作用的蛋白質，并由STRING 對這些蛋白產生的相互作用進行分析，得到KEGG 通路和GO 生物過程等分析報告，為FNDC5 的功能預測提供佐證。

2 結果

2.1 FNDC5 的基本性質 NCBI 數據庫中，FNDC5基因ID 為252995，定位為1p35.1，外顯子數為7。FNDC5 蛋白的GenBank 登錄號為AAH62297.1，共有153 個氨基酸，分子式為C762H1225N213O229S9，分子量為17.32294×103。經ProtParam 統計，組成該蛋白的氨基酸中谷氨酸（Glu）占比最高，為9.2%，共14 個；組氨酸（His）和酪氨酸（Tyr）占比最低，均為1.3%，分別有2 個。FNDC5 蛋白帶負電氨基酸殘基（谷氨酸、天冬氨酸）的總數為19，帶正電氨基酸殘基（賴氨酸、精氨酸）的總數同樣為19，理論等電點為6.74，因此該蛋白接近中性。FNDC5 蛋白的N 端氨基酸為甲硫氨酸，因此該蛋白的半衰期較長，在哺乳動物Rtc 中為30 h。FNDC5 蛋白的穩定性較差，其不穩定指數為50.58。此外，經分析FNDC5蛋白的脂肪族氨基酸指數為83.46。

Protscale 對FNDC5 蛋白的親疏水性分析如圖1A 所示（見封四），疏水性得分最高的氨基酸殘基是位于84 位的纈氨酸殘基（Val），得分為4.022；親水性得分最高的是位于109 和111 位的脯氨酸殘基（Pro）和天冬氨酸殘基（Asn），得分均為-3.378。從圖中可觀察到，組成該蛋白的氨基酸大都分布在親水區（負值），考慮到ProtParam對FNDC5 的平均親水性數值（grand average of hydropathicity，GRAVY） 預測結果為-0.370，認為該蛋白應為親水性蛋白。

FNDC5 的信號肽結構由SignalP 4.0 Server 預測，結果如圖1B 所示，圖中C、S、Y 值分別反映剪切位點、是否為分泌蛋白及前二者的綜合分析。報告顯示，C 值最大位于17 位，為0.112；Y 值最大位于5 位，為0.120，由圖可知此處討論S 值的平均值已無意義，且可判斷該蛋白無信號肽結構。不僅如此，SecretomeP 2.0a Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）顯示該蛋白的SecP 得分（NN-得分）僅0.096695，遠小于判定哺乳動物非經典分泌蛋白應超過的閾值0.6，因此FNDC5 不屬于非經典分泌蛋白。

FNDC5 蛋白的跨膜結構由TMHMM Server v.2.0 預測，結果如圖1C 所示，該蛋白存在1 個跨膜結構域（圖中紅色粗線），位于第79～97 位，1～74 位位于膜外，98～153 位位于膜內，是一個典型的跨膜蛋白。

2.2 FNDC5 的組織表達特異性和亞細胞定位 為了找到FNDC5 的組織表達特異性相關信息，筆者查找了NCBI 的2 個數據庫：基因庫和EST 數據庫。NCBI 基因庫對代表27 種不同組織的95 個人類組織樣本進行RNA-seq，以確定蛋白質編碼基因的組織特異性，以RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）為單位表示結果，FNDC5在心臟中表達量最高，達到13.532；在胰腺中表達量最低，僅為0.068；其余表達較高的組織有：肝臟（8.587），腎上腺（7.224），唾液腺（6.576），食管（5.168）等。NCBI 的EST 數據庫對FNDC5 基因表達量以TPM（transcripts per million）表示，表達量較高的組織有：肌肉131，眼95，肺89，心臟33，腦31，前列腺31，子房19，血管19，胚胎組織18，血液8。

對FNDC5 蛋白的亞細胞定位分析結果顯示，43.5%的FNDC5 蛋白定位于線粒體，52.2%分散于其他細胞器，另外4.3%位于細胞核內。

2.3 FNDC5 蛋白的二、三級結構 FNDC5 蛋白的二級結構由SOPMA 預測，如圖1D 所示，二級結構中無規卷曲（黃線）為主要結構，占全長的54.25%，α-螺旋（藍線）占24.18%，延長鏈（紅線）占18.95%，β-轉角（綠線）占2.61%，預測結果顯示除此之外可能不存在其他類型的二級結構。

為確定FNDC5 蛋白的保守結構域，通過NCBI相關數據庫對其進行了同源比對，結果如圖2（見封四）所示。FNDC5 蛋白共包含2 個不同的超家族結構域，分別為位于5～49 位的纖連蛋白3型超家族（FN3 superfamily）結構域，以及位于76～109 位的功能尚未明確的DUF4808 超家族（DUF4808 superfamily）結構域。

FNDC5 的三級結構由SWISS-MODEL 預測，該軟件共匹配到與FNDC5 相關的8 個模板進行建模，共得到1 個標準模型，結構如圖3所示，該模型的GMQE 為0.26，QMEAN 為-1.29，該蛋白不含配體，模型擬合率為100%。因此該模型應為FNDC5 的標準三級結構模型。

圖3 FNDC5 蛋白的三維結構預測

2.4 FNDC5 蛋白的翻譯后修飾位點 經轉錄和翻譯后形成的原始蛋白質往往不具有生物學功能，或處于無活性狀態，它們需要經過多種細胞器的加工和修飾，再經生物酶的催化或變構，才能最終發揮其應有的生物學特性。筆者對FNDC5 的一部分翻譯后修飾位點作了初步的預測，包括氧和氮的糖基化位點、蛋白磷酸化位點，這些位點對于蛋白質發揮自身生物學活性普遍起著十分重要的作用，預測這些位點的存在與否及其具體位置對于揭示蛋白質進一步的生物學現象、研發相關藥物、發掘相關通路等科研活動均具有重要意義。

O-糖基化位點由NetOGlyc 4.0 Server 預測，共發現2 個O-糖基化位點，分別是位于49 位的蘇氨酸（得分0.568393）和位于58 位的絲氨酸（得分0.720518），其中58 位的絲氨酸更有可能是真正的O-糖基化位點。N-糖基化位點由NetNGlyc 1.0 Server 預測，結果僅發現1 個可能的N-糖基化位點，是位于第9 位的天冬氨酸，得分為0.5771。NetPhos 3.1 Server 預測結果顯示，FNDC5蛋白可能的磷酸化位點較多，選取了可能性較大的7 個位點，以得分大于0.7 計，分別為：24 位的蘇 氨酸（0.744）、26 位的 酪氨 酸（0.949）、42 位的絲氨酸（0.847）、49 位的蘇氨酸（0.990）、118位的絲氨酸（0.997）、120 位的絲氨酸（0.994）和123 位的絲氨酸（0.973）。

2.5 FNDC5 蛋白的蛋白互作關系及分析 TRING對與FNDC5 可產生相互作用的蛋白進行了預測，設置置信度為0.7 后，共得出7 個與FNDC5產生相互作用的蛋白，分別為：UCP1（得分0.916）、MSTN（得分0.833）、LEP（得分0.789）、PPARGC1A（得分0.785）、BDNF（得分0.776）、FGF21（0.736）和FNDC9（0.726）。

蛋白互作分析結果中，KEGG 通路的報告結果如表1所示，與FNDC 蛋白相關的蛋白參與的信號通路共有8 種，其中，PPARGC1A 與LEP 共同參與的信號通路有hsa04920（脂肪細胞因子信號通路）及hsa04152（AMPK 信號通路），這2 個信號通路與肥胖及炎癥反應的發生、發展都具有重要關系。GO 生物過程分析表明，FNDC5 蛋白在體內參與肌肉活性應答及棕色脂肪細胞分化的調節，與其相關的蛋白也參與多種脂肪細胞生長分化、糖代謝、胰島素信號通路調節、炎癥反應及體內脂質代謝等多種生物學過程。可觀察到，FNDC5互作蛋白網絡中涉及的信號通路及生物過程，有相當一部分均與OSAS 的病理機制有關，這為本研究及分析提供了有力的理論支持。

表1 FNDC5 蛋白網絡中涉及的KEGG 通路分析

3 討論

通過各種生物信息學工具的預測分析，了解到FNDC5 蛋白是一種親水的近中性不穩定蛋白，在肌肉組織中的特異性表達較高，在細胞內線粒體中的分布最為廣泛。FNDC5 蛋白不屬于非經典分泌蛋白，擁有一個跨膜結構域。該蛋白的二級結構中無規卷曲所占比例過半，三級結構現已基本可確定。FNDC5 擁有屬于纖連蛋白3 型超家族和功能尚不明確的DUF4808 超家族的結構域，蛋白互作網絡中可看到其與肥胖及炎癥反應密切相關。經預測，該蛋白共有2 個O-糖基化位點和1個N-糖基化位點，可信度較高的蛋白磷酸化位點在預測中共確定7 個，這些結果表明FNDC5 具有進行進一步結構修飾的潛力。這些結構修飾可能增加鳶尾素促進脂肪代謝的能力，或降低組織對鳶尾素的耐受性，或改善血清鳶尾素的抗炎效果。雖然這些預測需要更深入的在體及體外實驗才能驗證，但本研究結果將為今后類似的研究及討論提供重要的有關鳶尾素結構、性質、功能方面的理論依據。

在KEGG 通路分析所提到的信號通路中，脂肪細胞因子信號通路及AMPK 信號通路被認為是與OSAS 密切相關的。由脂肪組織分泌的例如白介素-6、8、10 及TGF-β 等因子，不僅可通過誘導增加葡萄糖的攝取而促進肥胖的發生［10］，還與炎癥反應有關［11］，而脂肪細胞因子信號通路就是這些生物學過程發生的必要條件。AMPK 在能量代謝中意義重大，研究表明該通路可抑制脂肪組織中線粒體的形成，進而控制脂肪組織的生長［12］。此外，這2 條通路并不是相互獨立的，研究表明脂肪細胞因子可介導AMPK 信號通路［13-14］，因此，這2 條信號通路參與的生物學過程及發揮的生物學作用可能是相互交叉的。值得注意的是，在與FNDC5 產生相互作用關系的7 個蛋白中，LEP 與PPARGC1A 都同時參與了上述2 個信號通路。LEP 也稱瘦素，血清瘦素蛋白可與大腦中的相關受體結合并參與相關信號通路，抑制攝食并促進能量消耗。瘦素還具有內分泌功能，參與免疫和炎癥反應。PPARGC1A 是一種轉錄共激活因子，可調節參與能量代謝的基因的表達，還可參與控制血壓，調節細胞膽固醇穩態和肥胖的發展。在STRING 的分析報告中還指出，LEP 與PPARGC1A共同參與了白色脂肪細胞分化的轉錄調節這一反應途徑，而FNDC5 則為棕色脂肪生長的刺激因子，因此可推測，這3 種蛋白在脂肪組織的生長與發展過程中起到了十分密切的作用。不僅如此，眾多證據也表明，這3 種蛋白同樣與炎癥反應密切相關。綜合考慮OSAS 的發病機制，不難預測，FNDC5、LEP 及PPARGC1A 通過脂肪細胞因子信號通路及AMPK 信號通路，參與脂肪組織的發育并調節炎癥反應的發展，以肥胖、炎癥反應、內分泌調節等多種形式，誘導OSAS 的發生，并產生包括睡眠呼吸暫停在內的多種病理表現，加重OSAS患者的病情。

自FNDC5 與肥胖的關系被報道后，越來越多的研究人員開始關注由此可能引起的其他疾病，OSAS 就是其中之一［15］。雖然筆者的研究尚未進入實驗階段，研究結果仍具有一定的局限性，但通過可靠的生物信息學分析工具，對FNDC5 相關結構、性質、功能等作出了嚴謹的預測和分析，使FNDC5與OSAS 發病機制的相關關系得到了進一步揭示。相信在此基礎上進行進一步實驗探索后，人們對FNDC5 與OSAS 的認識將會有更大的突破。