非小細胞肺癌患者外周血中HIF-1α+MDSC比例對低氧條件下CD8+T細胞殺傷活性的影響

李潔瑤，張 毅，王麗萍

1)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤中心 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052

缺氧微環境在實體腫瘤的發展過程中發揮重要作用，涉及各種轉錄因子的活化以及多種復雜信號通路的調控[1]。腫瘤生長速度過快將導致多數實體瘤內部產生大面積缺氧區，在這個過程中，氧感應器低氧誘導因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)由于應答缺氧狀態會引起腫瘤微環境發生變化，從而促進腫瘤細胞為了存活做出適應性改變，如活化血管內皮生長因子以促進腫瘤血管生成[2]。髓源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)是一群異質性細胞群體，可以從功能和表面標記物兩方面進行區分和鑒別[3-4]。MDSC主要發揮免疫抑制作用，在腫瘤患者體內表現為抑制效應T細胞增殖和功能、促進腫瘤細胞繁殖和耐藥，從而促進腫瘤生長[5-6]。

肺癌的發病率和死亡率在全球癌癥中居首位;肺癌中約80%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，大部分NSCLC患者確診時已處于中晚期或者晚期，失去手術機會，其中近3/4的患者需要接受姑息性放化療[7]。本研究采集NSCLC患者外周血，檢測HIF-1α+MDSC的比例，分析其與患者臨床病理指標和療效的關系，以及HIF-1α+MDSC對CD8+T細胞殺傷活性的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象NSCLC患者35例, 均為2018年1月至12月鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科經病理學確診的住院患者。35例中男22例，女13例；年齡32～75歲，其中<65歲7例，≥65歲28例；腫瘤大小：T1～2 22例，T3～4 13例；19例無淋巴結轉移；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期13例；分化程度：高分化8例，中分化13例，低分化14例。35例之前均未接受過任何抗腫瘤治療，KPS評分>70分，預計生存期>3個月。健康供者29名(正常對照)，年齡32 ～75歲，中位年齡55歲；男20名，女9名。

1.2主要試劑和儀器FITC標記的CD3單抗、PE標記的CD8單抗、FITC標記的顆粒酶B單抗、APC標記的穿孔素單抗、APC標記的HIF-1α單抗、FITC標記的CD33單抗、AE標記的CD124單抗、APC-Cy7標記的CD14單抗、PE-Cy7標記的CD11b單抗、Percp標記的7AAD單抗及同型抗體均購自BD Pharmingen公司。CD8、CD14和CD11b磁珠均購自德國美天旎公司。超凈工作臺購自珠江市再鑫儀器有限公司，離心機購自Thermo Scientific公司，流式細胞儀購自BD Biosciences公司。

1.3外周血中相應細胞比例檢測無菌條件下抽取NSCLC患者與健康供者外周血6 mL(EDTA抗凝)，在6 h內，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。調整PBMC密度至1×106個/mL，避光加入免疫熒光抗體或相應同型抗體，混勻后室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測CD14+CD11b+細胞(M-MDSC)、CD14-CD11b+細胞(G-MDSC)、HIF-1α+MDSC、CD33+MDSC及CD124+MDSC等細胞的比例。

1.4NSCLC患者HIF-1α+MDSC對低氧條件下正常CD8+T細胞殺傷活性的影響根據目的細胞在總細胞液中的比例以及最終所需細胞量，大致計算出需要分選的PBMC總數，依次加入CD8磁珠、CD14磁珠和CD11b磁珠，分離出某一健康供者CD8+T細胞和患者G-MDSC、M-MDSC。取健康供者CD8+T細胞，分為6組，低氧組、低氧+抑制劑組、低氧+G-MDSC1組、低氧+G-MDSC2組、低氧+G-MDSC1+抑制劑組、低氧+G-MDSC2+抑制劑組。6組均用100 mol/L CoCl2誘導低氧培養環境，低氧+G-MDSC1組和低氧+G-MDSC2組CD8+T細胞和G-MDSC分別按1∶1和1∶4共孵育；低氧+抑制劑組、低氧+G-MDSC1+抑制劑組和低氧+G-MDSC2+抑制劑組在以上處理基礎上加入HIF-1α抑制劑(10 μmol/L MeOE2)。共孵育72 h后收集各組細胞，采用流式細胞術檢測CD8+T細胞分泌顆粒酶B和穿孔素水平。另取健康供者CD8+T細胞分為6組，即低氧組、低氧+抑制劑組、低氧+M-MDSC1組、低氧+M-MDSC2組、低氧+M-MDSC1+抑制劑組、低氧+M-MDSC2+抑制劑組，同上處理。

1.5治療及療效評價所有NSCLC患者均采用以鉑類為基礎的兩藥聯合化療方案治療4周期，每2周期評價一次療效。療效評價按照WHO制定的實體瘤客觀療效評定標準[8]分為：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩定(SD)和進展(PD)?；煰熜б訮R為好轉、SD+PD為未好轉分為2組。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0處理數據。NSCLC患者和正常對照外周血中HIF-1α+MDSC比例的比較采用兩獨立樣本t檢驗，HIF-1α+MDSC比例與CD33和CD124表達水平的相關性采用線性相關分析,HIF-1α+MDSC比例與NSCLC患者療效的關系采用χ2檢驗分析，HIF-1α+MDSC比例與NSCLC患者臨床參數的關系采用單因素方差分析或兩獨立樣本t檢驗分析，不同孵育比例和有無HIF-1α抑制劑對CD8+T細胞分泌顆粒酶B和穿孔素水平的影響采用2×3析因設計的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組外周血中HIF-1α+MDSC比例的比較NSCLC患者外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例均高于正常對照(表1)。

表1 2組外周血中HIF-1α+MDSC比例比較 %

2.2NSCLC患者HIF-1α+MDSC比例與其表面CD33和CD124含量的相關性HIF-1α+G-MDSC比例與其表面CD33和CD124比例呈正相關，HIF-1α+M-MDSC比例與CD33比例呈正相關(表2)。

表2 NSCLC患者HIF-1α+MDSC比例與其表面CD33和CD124比例的相關性

表中為r(P)

2.3不同臨床參數和療效NSCLC患者外周血HIF-1α+MDSC比例比較NSCLC患者外周血中HIF-1α+MDSC比例與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期、分化程度有關，見表3。35例NSCLC治療后均無CR病例。NSCLC患者以正常對照組HIF-1α+MDSC比例均值為界，HIF-1α+MDSC比例>11.0%為高比例組，≤11.0%為低比例組。35例患者中HIF-1α+MDSC比例高者19人，治療后6人好轉，比例低者16人，治療后12人好轉，HIF-1α+MDSC比例低者預后較好(P=0.018)。

2.4不同條件下NSCLC患者HIF-1α+MDSC對正常CD8+T細胞殺傷活性的影響結果見表4～7。結果顯示，NSCLC患者的HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC均可抑制正常CD8+T細胞分泌顆粒酶B和穿孔素的能力，即抑制CD8+T細胞的殺傷活性，其抑制作用呈一定的劑量依賴性。

表3 HIF-1α+MDSC比例與NSCLC患者臨床參數的關系

表4 不同條件下HIF-1α+G-MDSC對正常CD8+T細胞分泌顆粒酶B水平的影響

F孵育比例=15.670，P<0.001;F抑制劑=34.290,P<0.001;F交互=1.560，P=0.223

表5 不同條件下HIF-1α+G-MDSC對正常CD8+T細胞分泌穿孔素水平的影響

F孵育比例=6.960，P=0.012;F抑制劑=37.000,P<0.001;F交互=2.150，P=0.130

表6 不同條件下HIF-1α+M-MDSC對正常CD8+T細胞分泌顆粒酶B水平的影響

F孵育比例=7.480，P=0.009;F抑制劑=28.510,P<0.001;F交互=1.040，P=0.362

表7 不同條件下HIF-1α+M-MDSC對正常CD8+T細胞分泌穿孔素水平的影響

F孵育比例=6.400，P=0.015;F抑制劑=49.850,P<0.001;F交互=0.700，P=0.502

3 討論

大多數NSCLC患者確診時已達中晚期，失去手術根治的機會，既往化療是主要治療手段?；熞种颇[瘤增長、減輕腫瘤負荷的效率相對較低，且不良反應多，如粒細胞減少、末梢神經炎、脫發、疲乏和關節痛等[9]。隨著醫學研究的發展，靶向治療和免疫治療逐漸成為晚期腫瘤患者的首選治療方案。但靶向治療的缺陷在于快速耐藥，一代EGFR-TKIs平均耐藥時長約為6個月，而免疫治療，如PD-1單抗，仍有30%～50%患者對其無應答[10-11]。因此，尋找敏感靶點、提高腫瘤治療的有效率已成為迫在眉睫的問題。

MDSCs作為免疫抑制細胞，在抗腫瘤免疫中的作用日益被重視，許多針對其靶向治療的研究正在展開，明確MDSCs發揮功能的具體分子機制或途徑將極大提高治療的準確性和效率，同時降低不良反應。

本實驗采用流式細胞術對35例NSCLC患者和29例正常對照外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例進行檢測，結果顯示，NSCLC患者外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例均高于正常對照。其中，HIF-1α+G-MDSC比例與MDSCs表面CD33和CD124比例呈正相關，HIF-1α+M-MDSC比例與其表面CD33比例呈正相關。白介素-4受體(IR-4R)即CD124被認為是MDSCs的功能性表面標記物。研究[12-13]證明，IL-13/IL-4R通路從多方面調節M-MDSC功能；將外源性IL-13轉入健康人M-MDSC中可以促使MDSC活化為免疫抑制細胞，中和IL-4R 可以逆轉MDSC的免疫抑制功能。此外，本研究結果還顯示，臨床分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移及腫瘤分化程度低的患者外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例高于臨床分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移及腫瘤分化程度高者。另外，HIF-1α+MDSC比例高的NSCLC患者化療療效差，比例低者則化療療效好。

研究[14-15]表明，腫瘤患者MDSCs表面HIF-1α比例顯著升高，在促進腫瘤增長過程中發揮重要作用。因此，惡性腫瘤患者體內的腫瘤微環境中HIF-1α+MDSC可能發揮重要抑制功能[16]。本研究結果顯示，HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC均可抑制CD8+T細胞分泌顆粒酶B和穿孔素的能力，即抑制CD8+T細胞的殺傷活性，其抑制作用呈一定的劑量依賴性；HIF-1α抑制劑可增強CD8+T細胞分泌顆粒酶B和穿孔素的能力，即增強CD8+T細胞的殺傷活性。

綜上所述，在NSCLC患者中HIF-1α+MDSC比例高于正常對照組，其比例高低與臨床分期、淋巴結轉移及分化程度有關，且比例高者療效更差。體外實驗證實，HIF-1α+MDSC可降低CD8+T細胞的殺傷活性，造成免疫抑制，因此，HIF-1α+MDSC可作為評價預后的指標及腫瘤治療的新靶點。