一個(gè)發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙家系的遺傳學(xué)診斷

胡新超，毛澄源，史長(zhǎng)河，范麗媛，張 槊，胡正威，楊志華，范 雨，楊 靖，許予明

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙(paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD)是陣發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙疾病最常見(jiàn)的一種類(lèi)型。PKD的臨床特點(diǎn)為發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的反復(fù)不自主動(dòng)作，每次持續(xù)時(shí)間不超過(guò)1 min，對(duì)小劑量卡馬西平或抗癲癇藥治療有效[1]。PKD發(fā)病率很低(約為1∶150 000)，具有自愈傾向，患者常于兒童或青少年期發(fā)病，成年后癥狀緩解至完全正常[2]。大多數(shù)PKD呈常染色體顯性遺傳，存在不完全外顯性，少部分PKD散發(fā)存在。最初，位于16號(hào)染色體的EKD1區(qū)(16p11.2-q12.1)[3]、EKD2區(qū) (16q13-q22.1)[4]和非16號(hào)染色體的EKD3區(qū)[5]被認(rèn)為與家族性PKD有關(guān)。隨后，3項(xiàng)獨(dú)立的研究[6-8]鎖定位于16p11.2的PRRT2基因?yàn)榧易逍訮KD的致病基因。目前，國(guó)內(nèi)已鑒定出48個(gè)PKD家系，其中絕大多數(shù)家系攜帶PRRT2 c.649dupC(p.R217PfsX8)，此外還存在c.487C>T(p.Q163X)、c.649_650InsC(p.P217fsX7)和c.796C>T(p.R266W)等20多種致病突變[9]。本研究納入了一個(gè)PKD家系，總結(jié)了該家系的臨床特征并進(jìn)行基因檢測(cè)以協(xié)助臨床診斷和治療。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象先證者(Ⅲ-2)，男，20歲。以“發(fā)作性四肢僵硬扭曲12 a”為主訴至我院就診。患者7歲時(shí)常于精神緊張狀態(tài)下突然運(yùn)動(dòng)時(shí)出現(xiàn)雙手屈曲成固定形狀，意識(shí)清楚伴興奮感，嚴(yán)重時(shí)伴面部不可抑大表情；每次持續(xù)數(shù)秒后自行緩解，每日發(fā)作數(shù)次；情緒緊張時(shí)發(fā)作次數(shù)明顯增多，心情放松時(shí)減少。對(duì)小劑量卡馬西平治療有效。無(wú)癲癇、偏頭痛、嬰幼兒驚厥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病史。先證者既往被診斷為“精神心理疾病”“幼兒多動(dòng)癥”。神經(jīng)系統(tǒng)查體：神志清楚，對(duì)答流利，未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性體征。輔助檢查：EEG和顱腦MRI未見(jiàn)異常。

收集2019年1月至10月至我院體檢科檢查的健康人作為正常對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡5～50歲；既往體健；簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：有嬰兒驚厥、癲癇、偏頭痛及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病史。

1.2家系調(diào)查該家系(漢族)三代18人共有5例患者，見(jiàn)圖1。先證者母親(Ⅱ-2)，女，48歲。15歲常于他人呼叫提問(wèn)時(shí)出現(xiàn)無(wú)法控制的四肢不自主扭曲，每次持續(xù)不超過(guò)10 s后自行緩解，至24歲時(shí)癥狀自行好轉(zhuǎn)。患者癥狀不影響日常生活，未曾接受系統(tǒng)治療。無(wú)偏頭痛、癲癇及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病史。神經(jīng)系統(tǒng)查體未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性體征。輔助檢查：EEG和顱腦MRI未見(jiàn)異常。

先證者姨媽(Ⅱ-8)，女，42歲。14歲時(shí)出現(xiàn)與先證者及其母親相同癥狀，25歲癥狀完全消失，未曾接受系統(tǒng)治療。先證者2個(gè)雙胞胎表弟(Ⅲ-7和Ⅲ-8)，男，12歲，均于6歲時(shí)出現(xiàn)與先證者相同癥狀。

此外，先證者姥爺(Ⅰ-1)，男，80歲，既往有被害妄想病史，已治愈。先證者姥姥已故(Ⅰ-2)，既往于情緒激動(dòng)時(shí)出現(xiàn)四肢抽搐，意識(shí)清楚，不伴口吐白沫，給予對(duì)癥治療后緩解(具體不詳)。

圖1 PKD家族譜系圖

1.3基因組DNA的提取所有患者及先證者父親簽署知情同意書(shū)后，采集外周血5 mL于EDTA抗凝管。同時(shí)抽取200名正常對(duì)照的外周血。采用全血基因組DNA 提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取基因組DNA。Thermo ScientificTMNanoDropTMOne超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度。提取的DNA樣本于-20 ℃保存。

1.4目標(biāo)序列捕獲測(cè)序先證者DNA樣本送至北京金準(zhǔn)基因科技有限責(zé)任公司進(jìn)行基因包目標(biāo)序列捕獲測(cè)序。全自動(dòng)超聲破碎儀(新芝SCIENTZ08-Ⅲ)超聲打斷DNA樣本，得到200～300 bp的DNA片段。采用KAPA Library Preparation Kit構(gòu)建DNA文庫(kù)。對(duì)目標(biāo)基因編碼區(qū)及臨近剪切區(qū)的DNA進(jìn)行捕獲和富集。捕獲后的樣本進(jìn)行Illumina NovaSeq高通量測(cè)序。

1.5Sanger測(cè)序驗(yàn)證對(duì)家系內(nèi)所有患者、先證者父親及200名正常對(duì)照的目標(biāo)點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物序列5’-AGCCCCACCTGAACCAG-3’，下游引物序列5’-CAGAGGCTCTATTGCAGCG-3’。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：2×PCR Master Mix 12 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 15 μL。正向測(cè)序PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)，每循環(huán)降低0.6 ℃。反向測(cè)序PCR條件：95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小后進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與家系內(nèi)正常人(先證者父親)和200名正常對(duì)照進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1家系臨床特征本家系所有患者癥狀相似，具有以下特點(diǎn)：①突然運(yùn)動(dòng)改變、壓力等誘發(fā)肢體屈曲動(dòng)作。②發(fā)作時(shí)意識(shí)清楚。③每次持續(xù)時(shí)間不超過(guò)1 min，每日發(fā)作數(shù)次至十?dāng)?shù)次。④發(fā)病年齡1～20歲。⑤成年后癥狀完全緩解。⑥對(duì)小劑量卡馬西平和抗癲癇藥物治療有效。⑦排除神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病。該家系符合單純型PKD的診斷標(biāo)準(zhǔn)。與Ⅱ代患者相比，Ⅲ代患者發(fā)病年齡更早，癥狀更明顯。

2.2遺傳學(xué)分析目標(biāo)序列捕獲測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者PRRT2外顯子2存在一處雜合突變：c.535 C>T，導(dǎo)致 p.Q179* 氨基酸改變(谷氨酰胺>終止)。查詢(xún)HGMDpro 數(shù)據(jù)庫(kù)未發(fā)現(xiàn)該突變的報(bào)道。美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)院對(duì)PRRT2 c.535 C>T評(píng)級(jí)為疑似致病突變。Sanger測(cè)序顯示家系內(nèi)其余患者均攜帶此突變，家系內(nèi)正常人(先證者父親)未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變，符合家系內(nèi)共分離，見(jiàn)圖2。此外，200名正常對(duì)照未發(fā)現(xiàn)PRRT2 c.535C>T的存在，證實(shí)了PRRT2 c.535 C>T(p.Q179*)是該單純型PKD家系的致病突變。

上：先證者PRRT2 c.535C>T；中：先證者母親PRRT2 c.535 C>T；下：先證者父親正常

圖2Sanger測(cè)序結(jié)果

3 討論

PRRT2基因被報(bào)道與家族性PKD、家族性嬰兒驚厥伴發(fā)作性舞蹈手足徐動(dòng)癥、良性家族性新生兒癲癇2型有關(guān)[10]。目前國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的PRRT2突變大約有81種，其中包括36個(gè)截短突變、29個(gè)錯(cuò)義突變、3個(gè)延伸突變、6個(gè)剪接位點(diǎn)改變以及7個(gè)導(dǎo)致PRRT2完全缺失的改變[11]。這些突變大多位于第2和第3外顯子。此外，內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)致病突變也有報(bào)道[12]。

PRRT2基因有4個(gè)外顯子，編碼含340個(gè)氨基酸的富含脯氨酸的跨膜蛋白(PRRT2蛋白)。PRRT2蛋白含有兩個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[11]，主要定位于谷氨酸能軸突的突觸前膜，通過(guò)以下途徑負(fù)調(diào)節(jié)突觸傳遞：①與SNARE復(fù)合體聯(lián)結(jié)并參與SNARE復(fù)合體的組裝[13-14]。②與SNAP25蛋白和突觸標(biāo)簽蛋白1/2相互作用，共同調(diào)節(jié)Ca2+依賴(lài)的突觸囊泡胞吐[15-16]。③調(diào)節(jié)Nav1.2/Nav1.6通道介導(dǎo)的神經(jīng)元興奮[17]。無(wú)義突變使PRRT2蛋白的翻譯提前終止，截?cái)喟被┒说陌鈪^(qū)肽鏈并喪失羧基末端的跨膜結(jié)構(gòu)域[8]。截短的PRRT2蛋白不能錨定在細(xì)胞膜上而喪失正常的生理功能，引起神經(jīng)元興奮性紊亂，從而觸發(fā)PKD樣癥狀。另一方面，截短的PRRT2 mRNA可被細(xì)胞內(nèi)保護(hù)途徑無(wú)義突變介導(dǎo)的mRNA降解途徑降解，導(dǎo)致PRRT2單倍體不足，同樣可影響蛋白質(zhì)的功能而致病[18-19]。此外，PRRT2的無(wú)義突變被報(bào)道[20]與神經(jīng)元遷移能力減弱和神經(jīng)發(fā)育遲滯有關(guān)。小鼠腦組織PRRT2 mRNA水平在早期發(fā)育階段逐漸升高而成年后下降[8]，人腦中有類(lèi)似結(jié)果[11]。這與PKD患者青少年時(shí)期發(fā)病并且成年后有自愈傾向的特點(diǎn)一致。目前，PKD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰，其機(jī)制仍值得進(jìn)一步探究。

本研究中，我們?cè)谝粋€(gè)中國(guó)漢族單純型PKD家系中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)未曾報(bào)道的PRRT2 c.535 C>T(p.Q179*)致病突變，這一發(fā)現(xiàn)拓寬了PRRT2相關(guān)PKD的突變譜范圍。