CTRP9對血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠心肌成纖維細胞活化和增殖的影響

梁 翠，高 路，姚 瑞，李亞彭，李鵬程，劉 源，張殿紅，王 錚，張彥周

鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管內科 鄭州 450052

心肌纖維化是冠心病、心肌梗死和心肌病等心臟疾病向心力衰竭進展的必然過程[1]。目前認為，心肌成纖維細胞在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用[2]。在各種致病因素作用下，成纖維細胞活化為肌成纖維細胞，后者發(fā)生形態(tài)學改變，表達平滑肌α肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白，還可表達多種細胞因子及受體，具有收縮功能[3]。成纖維細胞大量增殖，合成大量的細胞外基質，最終導致心肌纖維化。C1q腫瘤壞死因子相關蛋白9(CTRP9)是CTRP家族成員之一[4]，研究[5]表明，CTRP9過表達可抑制糖尿病大鼠的心肌纖維化。2型糖尿病和冠心病患者血清CTRP9水平明顯升高，且與炎癥水平密切相關[6]。還有研究[7]發(fā)現，CTRP9可以通過抑制心肌細胞凋亡減輕心肌缺血/再灌注損傷。過表達CTRP9可減輕小鼠動脈粥樣硬化[8]。此外，近期研究[9]發(fā)現，人源重組CTRP9可以減輕異丙腎上腺素誘導的小鼠心肌損傷。上述研究提示CTRP9對心臟有保護作用，但其具體作用機制仍不清楚。本研究觀察了CTRP9對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的大鼠成纖維細胞活化、增殖的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料人重組CTRP9購于美國Abcam公司，磷酸化(p-)和總的(T-)mTOR、AMPKa及P70抗體購于美國CST公司，α-SMA抗體購于美國Abcam公司，GAPDH抗體購于美國Santa Cruz公司，AngⅡ購于美國Sigma公司，AMPKa抑制劑復合物C購于美國MedChem Express公司，CCK-8試劑盒購于上海碧云天公司，PCR反轉錄試劑盒購于美國羅氏公司。

1.2細胞培養(yǎng)取日齡1～3 d的SD大鼠乳鼠(購于北京華富康生物科技股份有限公司)心臟，置于10 mL DMEM/F12中；清洗后棄去培養(yǎng)基，用剪刀將心臟剪成1～2 mm3的組織碎塊；加入1.25 g/L的胰蛋白酶消化10 min，消化5次，棄去第1次消化液，收集后4次消化液；40 μm過濾網濾去細胞團塊。將濾液接種于兩個10 cm培養(yǎng)皿中，差時貼壁90 min(成纖維細胞貼壁，心肌細胞仍懸浮)，棄去心肌細胞，保留貼壁的成纖維細胞，取第2～3代的成纖維細胞用于后續(xù)實驗。細胞接種于6孔板用于qRT-PCR，接種于96孔板用于CCK-8檢測，接種于24孔板用于熒光染色，接種于10 cm培養(yǎng)皿用于蛋白提取。細胞用無血清的DMEM/F12孵育6 h后，按分組分別給予不同藥物進行處理。

1.3細胞分組①為觀察CTRP9對AngⅡ誘導的成纖維細胞增殖的影響，將細胞分為7組：對照組(不處理)，AngⅡ組(1 μmol/L AngⅡ刺激48 h)，10、25、50、100、200 mg/L CTRP9組(分別給予1 μmol/L AngⅡ和不同濃度CTRP9刺激48 h)。②為觀察CTRP9對AngⅡ誘導的成纖維細胞活化、膠原合成和AMPKa通路蛋白表達的影響，將細胞分為4組：對照組，AngⅡ組(1 μmol/L AngⅡ刺激48 h)，50、200 mg/L CTRP9組(分別給予1 μmol/L AngⅡ和不同濃度CTRP9刺激48 h)。③為觀察AMPKa抑制劑對CTRP9抗成纖維細胞活化、增殖及膠原合成的作用，將細胞分為4組：對照組，AngⅡ組(1 μmol/L AngⅡ刺激48 h)，CTRP9+復合物C組(細胞給予復合物C 10 μmol/L處理30 min后，再給予1 μmol/L AngⅡ和200 mg/L CTRP9刺激48 h)，CTRP9組(細胞給予1 μmol/L AngⅡ和200 mg/L CTRP9刺激48 h)。

1.4細胞增殖率的CCK-8法檢測各組細胞孵育48 h后，每孔加入1∶10稀釋的CCK-8溶液100 μL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h。采用酶標儀檢測450 nm處的光密度(OD)，計算細胞增殖率：細胞增殖率=處理組OD/對照組OD×100%。實驗重復6次。

1.5細胞中α-SMA的免疫熒光染色觀察取各組細胞，用PBS清洗細胞，40 g/L多聚甲醛固定，體積分數0.1%Triton X-100通透5 min，將抗α-SMA單克隆抗體用體積分數1%羊血清按1∶100進行稀釋后4 ℃孵育過夜。第2天用PBS清洗5次，加入二抗(1∶1 000稀釋的Alexa FluorH 488羊抗鼠單克隆免疫球蛋白)室溫孵育60 min。用PBS清洗6次，將細胞爬片轉移到載玻片上，使用DAPI進行染色，顯微鏡下觀察拍照。實驗重復3次。

1.6Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、結締組織生長因子mRNA表達的qRT-PCR檢測取各組細胞，用Trizol提取細胞總RNA，使用分光光度計測量純度，將RNA反轉錄為cDNA。采用LightCycler 480 SYBR?Green 1 Master Mix體系進行PCR擴增：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共42個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達量。實驗重復6次。

1.7AMPKa、P70和mTOR信號通路蛋白表達的Western blot檢測將各組細胞溶于裂解緩沖液中，采用BCA法測量蛋白濃度。使用SDS-PAGE膠分離組織裂解產物，然后轉移到PVDF膜上，再使用50 g/L脫脂牛奶封閉2 h。加入目的蛋白及內參GAPDH一抗(均按1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，加入二抗(羊抗兔HRP標記的IgG，1∶10 000稀釋)37 ℃孵育1 h。使用雙色紅外成像系統進行掃膜分析，計算磷酸化蛋白灰度值與總蛋白灰度值的比值。實驗重復6次。

1.8統計學處理采用SPSS 13.0進行統計分析。不同組間細胞增殖率，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、結締組織生長因子mRNA表達水平，p-AMPKa/T-AMPKa、p-mTOR/T-mTOR、p-P70/T-P70的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組成纖維細胞增殖率的比較AngⅡ組細胞增殖率高于對照組，5個CTRP9組細胞增殖率均低于AngⅡ組(表1)。

表1 各組成纖維細胞增殖率的比較

F=19.160，P<0.001；*：與對照組相比，P<0.05；#：與AngⅡ組相比，P<0.05

2.2CTRP9對AngⅡ誘導的成纖維細胞活化的影響結果(圖1)顯示，AngⅡ刺激48 h后心肌成纖維細胞α-SMA表達增多，50、200 mg/L的CTRP9均能減少α-SMA的表達。

A：對照組；B：AngⅡ組；C：50 mg/L CTRP9組；D：200 mg/L CTRP9組；綠色：α-SMA；藍色：細胞核

2.3CTRP9對AngⅡ誘導的成纖維細胞膠原合成的影響AngⅡ刺激48 h后，成纖維細胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白以及結締組織生長因子mRNA的表達增多，50、200 mg/L的CTRP9均能減少上述促纖維化因子的表達(表2)。

表2 各組成纖維細胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白以及結締組織生長因子mRNA表達的比較

*：與對照組相比，P<0.05；#：與AngⅡ組相比，P<0.05

2.4CTRP9對AMPKa信號通路的影響結果(圖2、表3)顯示：AngⅡ刺激48 h后，成纖維細胞AMPKa蛋白的磷酸化水平較對照組下降，而其下游的mTOR和P70磷酸化水平增加。與AngⅡ組相比，200 mg/L CTRP9組AMPKa磷酸化水平增加，mTOR和P70磷酸化水平降低。

2.5AMPKa抑制劑對CTRP9抗成纖維細胞增殖、膠原合成作用的影響結果見表4。

2.6AMPKa抑制劑對CTRP9抗成纖維細胞活化作用的影響AngⅡ組、CTRP9+復合物C組α-SMA熒光染色均強于CTRP9組(圖3)。

1：對照組；2：AngⅡ組；3：50 mg/L CTRP9組；4：200 mg/L CTRP9組

圖2各組成纖維細胞p-AMPKa、T-AMPKa、p-mTOR、T-mTOR、p-P70、T-P70的表達

表3 各組成纖維細胞p-AMPKa/T-AMPKa、p-mTOR/T-mTOR、p-P70/T-P70的比較

*：與對照組相比，P<0.05；#：與AngⅡ組相比，P<0.05

表4 各組成纖維細胞增殖、膠原合成能力的比較

*：與對照組相比，P<0.05；#：與AngⅡ組相比，P<0.05；△：與CTRP9組相比，P<0.05

A：對照組；B：AngⅡ組；C：CTRP9+復合物C組；D：CTRP9組；綠色：α-SMA；藍色：細胞核

3 討論

成纖維細胞活化、心肌纖維化的關鍵過程，是成纖維細胞對多種細胞因子及其他局部刺激的綜合應答反應[10]。多種細胞因子參與心肌纖維化，例如血小板源性生長因子、AngⅡ、轉化生長因子、結締組織生長因子等[11]。AngⅡ介導纖維化微環(huán)境的形成。AngⅡ作用于其受體， 通過活性氧依賴的Rho/Rac 及FAK依賴Ca2+/c-SRC通路激活轉錄因子AP-1，后者轉錄進入核內，在CREB 結合蛋白/p300作用下，啟動Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白等基因的表達[12-13]。AMPK是在細胞中廣泛表達的能量傳感器，通過影響線粒體生成、蛋白質合成及分解等在細胞的生長和分化過程中發(fā)揮重要作用。作為調控心肌能量代謝的關鍵因素，AMPK在心肌纖維化中發(fā)揮重要作用。成纖維細胞主要表達AMPKa，AMPKa活化可以通過下調TGF-β通路抑制成纖維細胞α-SMA的表達，即抑制成纖維細胞的成熟[14]。AMPKa基因缺失在無任何刺激的情況下對心臟左室結構或功能沒有影響，但可加劇心臟纖維化和心功能障礙[15]；相反，AMPKa激活能顯著降低心肌纖維化，其可通過抑制下游的mTOR、P70抑制心肌纖維化發(fā)展[16]。

作者采用10、25、50、100、200 mg/L的CTRP9處理大鼠心肌成纖維細胞，發(fā)現5種濃度的CTRP9均能夠有效抑制AngⅡ誘導的成纖維細胞增殖。因此作者采用中間和最大濃度即50和200 mg/L的CTRP9進行后續(xù)研究，發(fā)現50和200 mg/L的CTRP9均能減少成纖維細胞α-SMA的表達，即抑制AngⅡ誘導的成纖維細胞活化，有效減少Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白等促纖維化因子mRNA的表達，同時升高AMPKa的表達。最后經AMPKa抑制劑復合物C處理成纖維細胞后，發(fā)現CTRP9+復合物C組成纖維細胞的增殖率以及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白等促纖維化因子mRNA的表達水平高于CTRP9組，說明AMPKa抑制劑可阻斷CTRP9的抗成纖維細胞增殖、活化和膠原合成作用，提示CTRP9可能是通過AMPKa信號通路發(fā)揮其抗纖維化作用。

綜上所述，本研究結果提示CTRP9可通過激活AMPKa信號通路、減少促纖維化因子的表達，抑制AngⅡ誘導的大鼠心肌成纖維細胞活化、增殖和膠原合成功能，從而發(fā)揮抗心肌纖維化的作用。