hsa-miR-214-3p靶基因預測及其在兒童骨肉瘤中可能的調控機制

唐 煜，趙志華，于 磊，朱廣鐸，彭 誠，許朝君，鎬英杰

1)河南電力醫院兒科 鄭州 450006 2)鄭州大學第一附屬醫院病理科 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州 450052

骨肉瘤是最常見的原發性骨惡性腫瘤，也是兒童肉瘤相關死亡的首要原因，主要發生于股骨遠端和脛骨近端干骺端。骨肉瘤是高度侵襲性的腫瘤，最有可能轉移到肺[1]。骨肉瘤早期很難診斷，大約一半的患者會發生轉移，轉移或復發的患者5 a 生存率較低[2]。因此，尋找新的生物標志物來判斷骨肉瘤的預后至關重要。

miRNA可以通過靶向調控腫瘤細胞分化、增殖、凋亡和轉移相關基因，發揮抑癌或促癌的作用[3]。越來越多的研究[4-6]表明， miRNA表達與骨肉瘤患兒的預后關系密切。已有研究結果顯示，miR-214通過靶向TRAF3在骨肉瘤中起致癌基因的作用[7]；miR-214-3p可通過靶向CADM1促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[8]；miR-214可直接抑制LZTS1，從而促進骨肉瘤細胞的增殖和侵襲[9]；miR-214表達上調與兒童骨肉瘤的進展及不良預后有關[10]。本研究利用生物信息學方法分析miR-214的序列保守性，預測hsa-miR-214-3p的靶基因，并對其進行功能注釋、富集性分析及信號通路富集性分析，為深入研究 hsa-miR-214-3p在骨肉瘤中的生物學功能及調控機制提供依據，為尋找以hsa-miR-214-3p為靶點治療兒童骨肉瘤的方法提供理論指導。

1 資料與方法

1.1數據收集通過miRBase(http://www.mirBase.org/)分別檢索人、小鼠、大鼠、獼猴、黑猩猩、馬等物種的成熟miRNA序列，分析miR-214成熟序列在各物種間的保守性。利用PicTar、miRanda、RNAhybrid、TargetScan等4個數據庫進行hsa-miR-214-3p靶基因的預測，取交集，作為進一步分析的靶基因集合。

1.2數據分析應用R包ClusterProfiler中的Gene Ontology數據庫進行功能分類及富集性分析；利用KEGG數據庫對靶基因集合進行信號轉導通路及疾病通路富集性分析。富集顯著性閾值定為0.05。

2 結果

2.1成熟miR-214序列的保守性分析序列保守性分析結果見圖1，可見人、小鼠、大鼠、獼猴、黑猩猩、馬等多物種的成熟 miR-214序列存在完全相同的21個堿基，因而可認為miR-214在多物種間具有較高的保守性。

2.2hsa-miR-214-3p靶基因的預測利用PicTar、miRanda、RNAhybrid、TargetScan等4個數據庫預測并取交集，共發現靶基因454個(圖2)。

圖1 miR-214序列保守性分析

圖2 hsa-miR-214-3p靶基因預測

2.3靶基因的功能富集分析對454個靶基因進行功能注釋及富集分析，結果見表1～ 3。

2.4靶基因生物通路富集性分析預測的靶基因富集于TGF-β、Ras、cGMP-PKG、PI3K-Akt、Hippo、Wnt、cAMP、TNF、NF-kappa B信號通路，涉及細胞凋亡、細胞衰老、肝細胞癌、小細胞肺癌、乳腺癌、破骨細胞分化等通路(表4)。

表1 hsa-miR-214-3p預測靶基因參與的生物學過程

續表1

表2 hsa-miR-214-3p預測靶基因參與的分子功能

表3 hsa-miR-214-3p預測靶基因的細胞組分

表4 hsa-miR-214-3p預測靶基因的信號通路富集分析

3 討論

目前，骨肉瘤的病因尚不清楚,發病的危險因素有放療或化療史、Paget病或其他良性骨病變史,以及遺傳性疾病(包括遺傳性視網膜母細胞瘤、Lifraumeni綜合征、Rothmund-Thomson綜合征、Bloom和Werner綜合征等)。許多因素影響整個疾病過程和結局，包括年齡、腫瘤體積、腫瘤位置、手術切除緣、術前化療的組織學反應和無復發間隔時間等[11]。

miR-214是調控骨肉瘤發病的關鍵miRNA之一。本研究發現miR-214成熟序列在多物種間具有高度保守性，這說明相關動物實驗研究具有高度可信度與可推廣性。本研究結果顯示，hsa-miR-214-3p調控的靶基因參與的生物學過程主要包括囊泡介導轉運的調節、外源性凋亡信號通路、凋亡信號通路中線粒體膜蛋白插入的調控、BMP信號通路、Ras蛋白信號轉導的調控、腫瘤壞死因子介導的信號通路調控、骨生長、成骨細胞分化的調控、細胞衰老的負調節、TGF-β受體信號通路等；參與的分子功能包括細胞黏附分子結合、鈣黏蛋白結合、泛素樣蛋白結合、生長因子結合、NAD+激酶活性、磷脂酰肌醇磷酸鹽結合、核輸入信號受體活性、BMP受體結合、配體門控鈣通道活性、Ras-鳥苷酸交換因子活性等；參與構成的細胞組件包括細胞-基質連接、運輸小泡、高爾基體相關小泡、胞外小泡、轉錄抑制復合物、內質網管狀網絡、細胞質核糖核蛋白顆粒、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶復合物、核被膜等。

生物信息學分析發現RGMA、NEO1、ACVR1B、NBL1、ACVR2B等為hsa-miR-214-3p的潛在作用靶點，hsa-miR-214-3p可能通過調節這些基因間接調控TGF-β通路，從而在骨肉瘤轉移中發揮重要作用。體外實驗證實TGF-β1可促進骨肉瘤細胞系的遷移，具有促骨肉瘤血管生成的作用[12]。骨肉瘤患兒血清中TGF-β表達上調，其上調還與肺或其他部位的轉移、高級別骨肉瘤化療敏感性有關[13]。

本研究結果提示，Hippo通路異常在骨肉瘤生物學過程中有重要作用。Hippo通路成員中，只有YAP和TAZ在人骨肉瘤組織中被研究過。組織微陣列分析[14]結果顯示，與周圍非癌組織相比，骨肉瘤中YAP蛋白表達較高，且表達與臨床分期有關。在另一項免疫組化研究[15]中，骨肉瘤組織中YAP和TAZ的陽性率高達60%。本研究還發現，FZD7、SENP2、TBL1XR1、VANGL2、PLCB4等為hsa-miR-214-3p的潛在作用靶點，hsa-miR-214-3p 可能通過調節這些基因間接調控Wnt通路，從而在骨肉瘤發生和進展中發揮重要作用[16]。骨肉瘤組織中Wnt通路蛋白過度表達，包括wnt配體、fzs和lrp受體等，編碼內源性wnt通路抑制物(如wif-1)的基因則表觀遺傳沉默[16]。

綜上，hsa-miR-214-3p可能通過TGF-β、Hippo、Wnt等通路調控兒童骨肉瘤的發生、進展。但當前預測miRNA靶基因的數據庫數據較少，存在相關生物學知識和基因數據庫不完善的缺陷，故結果存在一定的假陽性。后期我們將針對hsa-miR-214-3p在兒童骨肉瘤發生發展中的作用開展動物和臨床研究，為開發以hsa-miR-214-3p為靶點的兒童骨肉瘤治療藥物提供新的思路和理論依據。