人胃腺癌組織中COX-2、iNOS和NF-κBp65蛋白的表達

李曉麗，林 銳，李繼昌，符 洋

1)鄭州大學第一附屬醫院老年病科；河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫院胃腸外科 鄭州 450052

環氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)為兩種誘生型酶，且兩者啟動子區域含有核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)結合位點。NF-κB作為一種重要的核轉錄因子，調節著多種基因的表達，并參與炎癥、免疫反應、腫瘤發生等多種生物學進程[1-3]。三者在胃腺癌組織中的表達及作用如何，目前少有報道。本研究采用免疫組化法對人胃腺癌組織中COX-2、iNOS及NF-κBp65蛋白的表達情況進行檢測，分析三者在胃腺癌發生發展中的作用，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1標本與試劑胃腺癌及其癌旁正常胃黏膜組織標本各85例均來源于我院病理科，為2016年3月至2017年12月手術切除標本。85例胃腺癌患者中，男49例，女36例；年齡33～78歲，≤60歲36例，>60歲49例；腫瘤直徑≤5 cm 39例，>5 cm 46例；分化程度：高、中分化52例，低分化33例；浸潤深度：浸潤淺肌層35例，浸潤深肌層50例；淋巴結轉移情況：無淋巴結轉移37例，有淋巴結轉移48例。所有患者均無長期服用糖皮質激素及非甾體抗炎藥物史，術前均未行化療或放療，病理證實均為腺癌。本研究經醫院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。兔抗人COX-2、iNOS多克隆抗體和鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體及SABC即用型試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司，DAB顯色試劑購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.2 2種組織中COX-2、iNOS及NF-κBp65蛋白的檢測采用免疫組化SABC法。常規組織切片脫蠟至水；體積分數3%H2O2封閉內源性過氧化物酶15 min；高壓抗原修復5 min；血清封閉劑封閉非特異性抗原，37 ℃20 min；分別滴加COX-2、iNOS、NF-κBp65一抗，稀釋度分別為1∶200、1∶100、1∶200，4 ℃孵育過夜(>12 h)；滴加生物素標記的二抗(按1∶100稀釋)37 ℃30 min；滴加SABC，37 ℃孵育30 min；DAB顯色后自來水沖洗；蘇木精復染，分化，脫水透明，封片。應用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知胃癌組織陽性染色切片作為陽性對照。綜合染色強度及陽性細胞計數對染色結果進行半定量分析[4]。COX-2、iNOS、NF-κBp65蛋白陽性表達呈棕黃色。高倍鏡下觀察并判定染色強度:無染色為0分,染色弱但明顯強于陰性對照為1分,染色清晰為2分，染色強為3分。每例觀察5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，陽性細胞比例<10%為0分，10%～為1分，25%～為2分，50%～為3分。結果取兩項評分之和，0～1分為陰性，≥2分為陽性。

1.3統計學處理采用SPSS 24.0進行統計學處理。胃腺癌和癌旁正常胃黏膜組織中COX-2、iNOS與NF-κBp65蛋白表達情況的比較采用配對資料的χ2檢驗；三者在胃腺癌組織中的表達與臨床病理學特征的關系采用χ2檢驗進行分析，三者間的關系采用Pearson等級相關進行分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1胃腺癌及癌旁正常胃黏膜組織中COX-2、iNOS與NF-κBp65蛋白的表達情況COX-2主要表達于胃腺癌細胞胞質和(或)胞膜中，呈彌漫狀分布。iNOS主要表達于胃腺癌細胞胞質和(或)胞膜中，呈顆粒狀分布。NF-κBp65主要表達于胃腺癌細胞胞質和(或)胞核中，呈彌漫狀分布。胃腺癌組織中COX-2、iNOS及NF-κBp65蛋白的陽性表達率均高于癌旁正常胃黏膜組織，見圖1、表1～3。

1：癌旁正常胃黏膜組織(×200)；2：胃腺癌組織(×400)；A:COX-2；B:iNOS;C:NF-κBp65

表1 胃腺癌及癌旁正常胃黏膜組織中COX-2蛋白的表達情況 例

表2 胃腺癌及癌旁正常胃黏膜組織中iNOS蛋白的表達情況 例

表3 胃腺癌及癌旁正常胃黏膜組織中NF-κBp65蛋白的表達情況 例

2.2胃腺癌組織中COX-2、iNOS、NF-κBp65蛋白的表達與臨床病理學特征的關系胃腺癌組織中COX-2、iNOS及NF-κBp65蛋白的表達與患者的性別、年齡和腫瘤直徑無關；而三者與胃腺癌的組織浸潤深度和有無淋巴結轉移有關，浸潤深肌層組陽性表達率高于浸潤淺肌層組，有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組；COX-2蛋白在高、中分化胃腺癌組表達高于低分化組，而iNOS及NF-κBp65蛋白表達與胃腺癌分化程度無關。見表4。

表4 胃腺癌組織中COX-2、iNOS、NF-κBp65蛋白的表達與臨床病理學特征的關系 例

2.3胃腺癌組織中COX-2、iNOS、NF-κBp65蛋白表達的關系COX-2與NF-κBp65表達呈正相關(rP=0.359,P<0.001)；iNOS與NF-κBp65表達呈正相關(rP=0.405,P<0.001)，見表5。COX-2與iNOS表達呈正相關(rP=0.366，P<0.001)，見表6。

表5 胃腺癌組織中COX-2、iNOS與NF-κBp65蛋白表達的關系 例

表6 胃腺癌組織中COX-2與iNOS蛋白表達的關系 例

3 討論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發病率與病死率均較高[5]。早發現與早診治是降低胃癌病死率的重要措施。因胃癌中95%以上為胃腺癌，故本實驗選取胃腺癌組織進行檢測，并初步探討COX-2、iNOS及NF-κBp65與胃腺癌發生發展的關系。

COX是花生四烯酸轉化為前列腺素過程中的關鍵性限速酶。COX 存在兩種同工酶，即COX-1和COX-2，COX-2呈誘導型表達，當出現組織損傷、炎癥或腫瘤時其表達增強[6-8]。COX-2主要分布在核膜，故其產物更容易進入核內而調節靶基因的轉錄，它可被迅速誘導，且誘導生成的COX-2量隨細胞類型的不同而改變。本研究結果顯示，COX-2蛋白的陽性表達主要定位于胃腺癌細胞的胞質和(或)胞膜中，呈彌漫狀分布。胃腺癌組織中COX-2的表達高于癌旁正常組織，且COX-2蛋白在高中分化、浸潤深肌層及有淋巴結轉移的胃腺癌組織中的陽性表達率更高。提示COX-2與胃腺癌的發生發展有關，且可能為其早期事件，COX-2在分化較好的胃腺癌組織中的異常高表達可能與其他旁分泌途徑有關。

一氧化氮(NO)是一種重要的內源性調節因子，在哺乳動物體內由一氧化氮合酶進行催化，利用L-精氨酸-NO途徑生成。NO在生物體內的功能依據部位及NOS的種類不同而存在差異，NOS的3種同工酶包括神經型一氧化氮合酶、內皮型一氧化氮合酶和iNOS。iNOS 在正常生理狀態不表達,但在病理條件下通過催化NO因子來實現其病理性生物學過程，其中iNOS誘導生成的過量NO是其產生病理作用的基礎，且與炎癥及腫瘤形成等密切相關[9]。另有研究[10]證明,NO既能提高血管內皮生長因子的生物學功能，又能激活COX-2而促進前列腺素的生成，這兩種因子又可加速腫瘤新生血管及腫瘤的生長。本研究結果顯示，iNOS蛋白陽性表達主要位于胃腺癌細胞胞質和(或)胞膜中，呈顆粒狀分布。胃腺癌組織中iNOS的表達高于癌旁組織，且浸潤深肌層及有淋巴結轉移的表達更高。提示iNOS通過誘導生成NO而參與胃腺癌早期的形成，同時作為一種重要促侵襲轉移因子可加速胃腺癌的進展。所以，其對胃腺癌的早期診斷及晚期預后判斷具有一定的臨床意義。

NF-κB為一種重要的多向性細胞核轉錄因子，NF-κB被激活后進入細胞核內發揮其重要作用，并參與炎癥、免疫、腫瘤生成等過程。目前，NF-κB靶基因仍不十分清楚，但已知有炎癥性細胞因子(IL-6、TNF-α等)、趨化因子(IL-8、MCP-1等)、MCH-1、COX-2、iNOS等，它們均為其誘生物，其中COX-2、iNOS是啟動子含有NF-κB結合位點的兩種誘生酶，而在細胞核內激活的NF-κBp65 又可促進COX-2和iNOS的合成[11-12]。本研究結果顯示，NF-κBp65蛋白的陽性表達主要定位于胃腺癌細胞胞質和(或)胞核中，呈彌漫狀分布。胃腺癌組織中NF-κBp65蛋白的表達高于癌旁組織，且浸潤深肌層及有淋巴結轉移的更高。另外，COX-2、iNOS與NF-κBp65蛋白在胃腺癌組織中呈高表達狀態，且三者間存在正相關關系。提示NF-κBp65在刺激因素作用下被激活，從細胞質轉移至細胞核內，然后與COX-2、iNOS啟動子區域的NF-κB結合位點結合，啟動COX-2和iNOS基因轉錄并促進其生成，兩者再通過不同途徑共同參與胃腺癌的發生、發展和轉移的全過程。

綜上所述，COX-2、iNOS與NF-κBp65在胃腺癌細胞中的表達和分布具有相似性，且COX-2、iNOS與NF-κBp65表達存在正相關關系，COX-2和iNOS的表達調控可能與NF-κBp65有關。COX-2、iNOS與NF-κBp65共同參與了胃腺癌的形成，且與晚期胃腺癌的侵襲、轉移有關，影響預后。