葡聚糖包裹超順磁性氧化鐵納米材料用于關節軟骨磁共振T2-Map成像研究

楊濱羽，羅霞，劉佳伶，何淼，李偲羽，嚴浩吉，吳君

(1.川北醫學院影像學院醫學影像診斷專業，四川 南充 637000；2.川北醫學院影像學院生物醫學工程教研室，四川 南充 637000)

1 引 言

磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)成像造影劑是一種在磁共振掃描過程中為了增強掃描效果從而更清楚分辯組織的順磁物質。粒徑小于20 nm的磁性氧化鐵粒子在外加磁場下即具有超順磁性[1]，稱為超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxid，SPIO)納米顆粒，是一種良好的MRI造影劑[2]，主要用于T2-Map成像。葡聚糖是一種具有良好水溶性及生物相容性的低聚糖，經過葡聚糖表面修飾的SPIO顆粒更加穩定，不易發生團聚[3-4]，在MRI成像過程中的增強效果更優異。關節軟骨是一種具有彈性的結締組織，幾乎無血管系統、淋巴系統和神經的分布。其營養物質只能依靠關節在伸展或放松時外力擠壓進出。為尋找一種能有效進入關節軟骨并具有良好增強對比能力的MRI造影劑，本研究選取體重在3～3.5 kg的6月齡新西蘭白兔(n=3)，將SPIO材料經過葡聚糖修飾后，經膝關節腔內注射，并進行磁共振增強成像以及組織學檢測，得出該種材料對于關節軟骨在磁共振T2-Map成像上的適用性，從而在選擇造影劑對膝關節軟骨的T2-Map成像上提供更多思路。

2 實驗材料及原理

2.1 材料制備

2.1.1主要原料和試劑 葡聚糖(Mw=70 000)，上海生工生物工程公司；FeCl3·6H2O、 FeCl2·4H2O，阿拉丁；濃氨水、檸檬酸、檸檬酸鈉，國藥集團化學試劑公司。

2.1.2分析測試儀器 納米粒度-電位檢測儀，Zetasizer Nano ZS，英國 Malvern 公司；掃描電子顯微鏡，S-4800，Hitachi；原子吸收光譜儀，AA800, Perkin-Elmer，US；NIKONECLIPSE80i共聚焦熒光顯微鏡。

2.1.3葡聚糖包裹的SPIO材料合成 取10.015 g葡聚糖置于50 mL的三口燒瓶中，加入20 mL純水，在超聲下使其溶解。然后加入0.697 g FeCl3·6H2O。在惰性氣體保護下將 0.282 g FeCl2·4H2O加入上述溶液中，待其完全溶解后將三口瓶置于冰浴中，在快速攪拌下緩慢滴加1 mL濃氨水(25%～28%)，繼續攪拌5 min后撤去冰浴,轉為油浴加熱。待反應體系溫度達到 80 ℃后,恒溫95 min[5]。反應停止后，使其自然冷卻至室溫，5 000 rcf下離心15 min除去大顆粒。離心結束后，取上清液，用十萬分子量的透析袋在檸檬酸鈉緩沖液中透析2 d，然后濃縮至合適濃度待用。

2.1.4葡聚糖SPIO材料的鐵濃度測定 通過設置對照，配置標準溶液并測定出線性相關系數大于0.999的吸光度與鐵濃度標準曲線，獲得標準濃度曲線值。再取一定體積制備好的葡聚糖SPIO材料，加入王水稀釋，通過原子吸收光譜儀測定稀釋后的樣品濃度，并計算出母液樣品濃度。最終計算出葡聚糖包裹的SPIO材料鐵濃度為 5.512 mg/mL，經生理鹽水稀釋至0.05 mg/mL備用。

2.1.5葡聚糖SPIO納米顆粒的表征測定 用去離子水稀釋葡聚糖SPIO納米顆粒溶液，吸取1 mL溶液于石英皿中，使用納米粒度-電位檢測儀對納米顆粒的形貌及其粒徑分布進行檢測。再吸取50 μL稀釋后的溶液滴至單晶硅表面，室溫下自然揮發，然后將其置于日立S-4800掃描電鏡下進行觀察。分別通過動態光散射(dynamic light scattering ，DLS)和掃描電鏡進行觀察分析，見圖1，葡聚糖SPIO納米顆粒的平均粒徑為(18.0 ± 8) nm ，且均勻分散，粒徑分布窄。

圖1葡聚糖氧化鐵納米顆粒的粒徑分布及掃描電鏡圖

Fig.1Size distribution and SEM of dextran-coated SPIO nanomaterials

2.2 葡聚糖SPIO材料體外MRI

磁共振成像造影劑用于增強影像觀察效果，而葡聚糖SPIO材料作為T2造影劑的主要機制是縮短T2弛豫時間。為了更加客觀地描述該材料的作用效果，我們引入“弛豫效能”(relaxivity, r)這一概念[6]。

(1)

其中，r2表示造影劑T2弛豫效能；obs表示該造影劑某濃度下實際測得的弛豫率，即弛豫時間倒數；d表示組織中抗磁性物質的弛豫率，可認為是常數；[CA]表示造影劑濃度。

在3.0T臨床磁共振上對葡聚糖包裹的SPIO進行體外磁共振T2WI成像，測量其弛豫效能。配置不同濃度的樣品，通過數據擬合得到每種濃度樣品的T2弛豫時間。然后再通過T2弛豫率與Fe濃度做線性擬合，計算出葡聚糖包裹的SPIO納米材料的T2弛豫效能為57(s-1mM-1)，見圖2。

2.3 T2-Map設計與算法

圖2 (a).橫向弛豫效能r2在3.0T下是57(s-1mM-1);(b).T2WI和T2(ms)

3 實驗方法

3.1 造影劑對軟骨T2-Map成像的效果

在兔膝關節腔內直接注射制備的0.5 mg/mL葡聚糖SPIO材料0.25 mL，并進行磁共振掃描，對取得的T2加權圖像進行處理得到T2-Map，應用matlab進行圖像后處理，得到軟骨的局部偽彩圖并進行定量分析，見圖3。

圖3軟骨T2-Map偽彩圖

Fig.3Pseudo-color diagram of cartilage T2-Map

將0 h(control)與24 h的T2-Map和3D-curve對照并進行比較，相比0 h，24 h中的色階整體的藍色更深，表明圖像中顯示的T2值有了較明顯的下降，由此可得，在24 h內，葡聚糖SPIO材料進入了軟骨內且尚未完全被排出至細胞外基質之外[9]。由于2次MRI成像的定位不易保持在同一層面上，所以部分異常信號帶未出現在同一位置。

3.2 組織學驗證

三價鐵離子可在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產生普魯士蘭(Fe4[Fe(CN)6]3)反應，能夠通過組織切片有效檢測出葡聚糖SPIO材料在軟骨內的分布情況。在24 h掃描結束后，將3只實驗兔行耳靜脈注射空氣法處死，取出股骨髁，做矢狀面切片，經普魯士蘭染色，送至成都里來生物公司處理完成。

4 結果與分析

4.1 軟骨T2弛豫時間的分析

3組兔膝關節腔(n=3)注射了18 nm葡聚糖SPIO后，對其進行MRI增強掃描并定量分析。

見圖4，計算關節軟骨T2的均值與標準差，軟骨24 h對應的T2值低于0 h(control)對應的T2值，表明24 h內，葡聚糖SPIO材料進入了軟骨內且尚未完全被排出至細胞外基質之外。

圖4 軟骨T2值減少

4.2 組織學分析

經普魯士藍鐵染色發現，注射造影劑后24 h，軟骨內仍然存在著 SPIO 。鏡檢發現注射的 SPIO 造影劑在軟骨細胞的陷窩中和軟骨基質內均存在藍染顆粒(見圖5中箭頭所指))，這說明軟骨細胞的攝取作用對造影劑有很大影響。由于 SPIO 是滲透進入軟骨，而軟骨層很薄，約在0.2 mm左右。假設均勻分布到整個軟骨面(約100 mm×100 mm)，切片厚度 4 μm (矢狀面切片)，因為軟骨是無血管的，不像肝臟等有血管組織會密集分布 SPIO，所以在單張切片上 SPIO 即使有也不會很多。故僅可在部分切片中觀察到軟骨細胞陷窩內和基質中含有藍染顆粒。

圖5 兔膝關節軟骨普魯士藍染色

組織學普魯士藍染色證明了本研究制備的18 nm粒徑葡聚糖包裹的SPIO顆粒可以滲透入兔膝關節軟骨內。

5 結論

關節軟骨內無神經血管分布，關節囊分泌的滑液是軟骨獲取營養成分及物質代謝的重要途經。在關節活動過程中，本研究制備的SPIO顆粒依靠滑液的運輸以及機械擠壓作用進入軟骨基質，經軟骨細胞吞噬，24 h后行組織學染色發現仍有殘留。在進一步靶向SPIO納米顆粒評估骨關節炎軟骨退變的研究中，發現注射SPIO造影劑96 h后，軟骨細胞內仍有蓄積，這很可能與軟骨細胞的胞飲作用有關，這一點在本研究和后續的研究結果與Rothenfluh等的研究結果一致[10]，同時進入軟骨細胞外基質中的SPIO顆粒最終經機械擠壓模式將異物以基質-滑液-淋巴引流的代謝途徑排出。超順磁性氧化鐵顆粒最初用于靜脈給藥的增強磁共振T2-Map成像，在近年研究中主要用于心肝腎等器官，脈管、神經等系統的活體示蹤，藥物靶向研究，干細胞培養等[11-15]，在軟骨部位一般用于軟骨細胞的SPIO標記，在體外培養軟骨細胞并移植到軟骨層進行組織修復方面的研究，或通過靜脈注射釓類造影劑進行軟骨增強磁共振成像[16]，直接用于關節腔內注射SPIO造影劑進行軟骨磁共振增強成像的研究較少。

本研究制備了粒徑(18 ± 2) nm的葡聚糖包裹的超順磁性氧化鐵納米顆粒，作為磁共振T2造影劑，對兔關節軟骨進行增強MRI掃描。該材料被注射關節腔前后24 h，分析得出軟骨的T2弛豫時間均下降。進行組織病理學普魯士蘭染色，發現軟骨基質及細胞內均有氧化鐵納米顆粒的存在，說明葡聚糖包裹SPIO納米材料可應用于關節軟骨磁共振增強成像。為下一步的SPIO納米顆粒載藥系統，即診療一體化磁共振探針的設計奠定了基礎，為骨關節炎軟骨退變的診斷及治療提供更多思路。