基于柵藻延遲發(fā)光表征中藥藥性的方法學(xué)驗(yàn)證*

閔令圓,龐靖祥,楊美娜,周寶宸,荊綺,韓金祥△

(1. 濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250020；2. 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)， 濟(jì)南 250062)

1 引 言

中藥藥性之四氣亦稱四性，中國藥典對(duì)所有的中藥均進(jìn)行了“藥性”的描述，即寒、熱、溫、涼。但目前仍缺乏一種公認(rèn)的對(duì)中藥藥性的量化指標(biāo)。生物光子輻射，也稱為超微弱生物發(fā)光(UPE),廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物與藻類中，強(qiáng)度較低[1]。目前，UPE測(cè)量用于評(píng)估氧化狀態(tài)和用于表征人體光學(xué)狀態(tài)等[2-3]。超微弱發(fā)光起源于生物系統(tǒng)內(nèi)一個(gè)高度相干的電磁場(chǎng),攜帶著生命系統(tǒng)內(nèi)部的完整信息，這便是生物光子相干性理論[4-5]。我們發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥理論與生物光子相干性理論存在可通約性[6]，“氣”與機(jī)體電磁輻射基本特征相一致，于是有研究提出可用生物光子相干性理論等現(xiàn)代理論及其技術(shù)轉(zhuǎn)化中醫(yī)藥理論[7]。經(jīng)過大量研究后發(fā)現(xiàn)，利用柵藻作為生物指示劑，加入中藥煎煮液，測(cè)量其延遲發(fā)光動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，將其延遲發(fā)光的平均強(qiáng)度 (IW) 與時(shí)間 (t) 進(jìn)行線性擬合，得到的線性擬合方程斜率K可以定量化表征中藥藥性[8-11]。

利用柵藻作為生物指示劑來定量化表征中藥藥性，該方法具有操作簡單、靈敏度高、易于獲得等特點(diǎn)。 并且相比還原論的方法，運(yùn)用生物光子相干性理論研究中藥藥性是以整體論為哲學(xué)思想，契合中醫(yī)基礎(chǔ)理論。為了進(jìn)一步將該方法標(biāo)準(zhǔn)化，我們對(duì)柵藻的波動(dòng)范圍進(jìn)行了優(yōu)化，并參照中國藥典中所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[12-14]，對(duì)其儀器背景噪聲、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、空白溶劑干擾等項(xiàng)目進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)，從而大大提高了柵藻延遲發(fā)光表征中藥藥性這一方法的準(zhǔn)確性、科學(xué)性和可行性，也為建立一種符合中醫(yī)藥理論基礎(chǔ)的藥性評(píng)價(jià)體系與指標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)材料

生物指示劑：柵藻(Scenedesmus sp.)，編號(hào) FACHB-933，購于中國科學(xué)院武漢水生生物研究所， 使用 BG11 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。柵藻批次1，2018年6月8日購入；柵藻批次2，2019年1月2日購入。

主要儀器設(shè)備：YPMS-2生物光子測(cè)量儀、PM20SP型光電倍增管高壓電源、尤尼科紫外分光光度計(jì)、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、智能光照培養(yǎng)箱、尚朋堂電陶爐、康舒砂鍋、石英比色皿、ACCULAB電子天平、燒杯、250 mL量筒、50 mL離心管、錐形瓶、移液槍。

中藥：黃芩，產(chǎn)地河北，購自山東建聯(lián)盛嘉中藥有限公司中藥飲片廠。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 柵藻波動(dòng)范圍測(cè)定

柵藻混合液在波長680 nm下吸光度 (A) 與細(xì)胞濃度 (C) 的線性方程為C= (A×11.995+0.1502 ) × 106個(gè)/mL ( r2= 0.9766 )。實(shí)驗(yàn)中選取兩個(gè)不同批次柵藻，控制其吸光度A=2.5(即C=3.0×107個(gè)/mL)

調(diào)節(jié)檢測(cè)室溫度為恒溫20 ℃，調(diào)節(jié)生物光子測(cè)量儀YPMS-2至性能最佳狀態(tài)，即制冷系統(tǒng)溫度-21℃，高壓1 348 V，保證儀器的最佳靈敏度和信噪比。將3 mL吸光度A=2.5的柵藻混合溶液轉(zhuǎn)入石英比色皿中，放入YPMS-2生物光子測(cè)量儀的暗室內(nèi)，進(jìn)行激發(fā)延遲發(fā)光的檢測(cè)。儀器設(shè)置為光源∶White-LED；測(cè)量點(diǎn)∶900；選擇測(cè)量方法∶DL；測(cè)量時(shí)間∶1.000000；光照時(shí)間∶10；重復(fù)次數(shù)∶7。實(shí)驗(yàn)前后均進(jìn)行儀器空箱噪聲測(cè)量，保證前后測(cè)量數(shù)值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以確定儀器的穩(wěn)定性及結(jié)果的準(zhǔn)確性。并使用相同方法連續(xù)測(cè)量41～60 d內(nèi)柵藻的延遲發(fā)光。

3.2 加入中藥煎煮液的柵藻延遲發(fā)光測(cè)量

3.2.1中藥煎煮液的制備 精確稱量黃芩10 g, 置于煎煮鍋中，再添加200 mL水，浸泡藥材。30 min后，加熱煎煮鍋，定時(shí)15 min，功率2 200 w。液體加熱至沸騰后，功率轉(zhuǎn)為800 w，使用六層紗布過濾煎煮液。過濾后的煎煮液暫存于250 mL的燒杯中，將殘?jiān)匦路呕厣板佒信c新量取的200 mL水混合，煎煮方法同上。第二次過濾后將砂鍋內(nèi)的藥渣除凈，將兩次獲得的煎煮液混合后再次加入砂鍋中，使用電陶爐2 200 w功率加熱，煎煮液沸騰后改為800 w，濃縮至終體積50 mL(終濃度為0.2 g/mL)，轉(zhuǎn)入50 mL離心管并冷卻至室溫后，4 ℃保存(第二天使用)。

3.2.2中藥煎煮液的延遲發(fā)光測(cè)量 取100 μL中藥煎煮液上清，加入至柵藻混合液中，吹打混勻后，轉(zhuǎn)入YPMS-2生物光子測(cè)量儀的暗室內(nèi)，進(jìn)行激發(fā)延遲發(fā)光的檢測(cè)。檢測(cè)方法同3.1節(jié)。

3.3 數(shù)據(jù)處理分析[8]

使用軟件Statistica 10.0處理延遲發(fā)光實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用式 ( 1 ) 進(jìn)行“雙曲”擬合，式 ( 2 ) 計(jì)算延遲發(fā)光平均強(qiáng)度(IW)，將IW與t進(jìn)行線性擬合，得到相應(yīng)的線性擬合方程。其中斜率K表征了柵藻在不同的液體環(huán)境中延遲發(fā)光的動(dòng)力學(xué)演化行為，可表征樣品性質(zhì)。

I(t)=A×csch2(t/B+C)

(1)

IW=A×B/W×[cothC-coth (W/B+C)]

(2)

其中，A為強(qiáng)度參量，B為特征時(shí)間，C為位相因子，W為總的測(cè)量時(shí)間。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1儀器背景噪聲 實(shí)驗(yàn)前后進(jìn)行系統(tǒng)背景噪聲的測(cè)量，選擇背景測(cè)量，點(diǎn)間隔1 s，測(cè)量時(shí)間15 min，激發(fā)光源為White-LED，激發(fā)時(shí)間為10 s，連續(xù)測(cè)量10 d，實(shí)驗(yàn)前后背景系統(tǒng)噪聲在一個(gè)光子差值內(nèi)，認(rèn)為儀器系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)，儀器精密度良好。

3.4.2精密度實(shí)驗(yàn) 取同一管黃芩煎煮液的上清按照3.2.2節(jié)方法連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)7次，數(shù)據(jù)按照3.3節(jié)方法進(jìn)行處理，若是7次試驗(yàn)K值的RSD<4%，則精密度符合要求。

3.4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同批次的黃芩7份，煎煮成藥液后，取上清，按照3.2.2節(jié)方法連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)7次，數(shù)據(jù)按照3.3節(jié)方法進(jìn)行處理，若是7次重復(fù)試驗(yàn)K值的RSD<8%,則重復(fù)性符合要求。

3.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一管中藥煎煮液的上清，按照3.2.2節(jié)方法分別在0、4、8、12、24、48、72 h進(jìn)樣檢測(cè)，數(shù)據(jù)按照3.3節(jié)方法進(jìn)行處理，若是7次試驗(yàn)K值的RSD < 4%,則穩(wěn)定性符合要求。

3.4.5空白實(shí)驗(yàn) 分別將空白溶劑(無菌水)100 μL和培養(yǎng)基BG11 100 μL加入到3 mL柵藻中，按照3.2.2節(jié)方法，連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)7次，數(shù)據(jù)按照3.3節(jié)方法進(jìn)行處理，若兩者K值無顯著性差異，表明空白溶劑對(duì)本實(shí)驗(yàn)沒有干擾。

4 結(jié)果與討論

4.1 柵藻K值波動(dòng)范圍測(cè)定

本研究通過測(cè)量柵藻作為生物指示劑使用時(shí)，其最佳生長階段 ( 41～60 d ) 內(nèi)的延遲發(fā)光數(shù)據(jù)，得到柵藻K值的波動(dòng)范圍，利用生物光子的手段，對(duì)柵藻的生長狀態(tài)進(jìn)行描述，并且優(yōu)化柵藻的可使用范圍。表1給出了不同批次的柵藻在41～60 d內(nèi)的7次激發(fā)延遲發(fā)光的平均強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的線性方程及線性擬合斜率K。我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)批次的柵藻在20 d內(nèi)的激發(fā)延遲發(fā)光斜率K比較穩(wěn)定，波動(dòng)較小，見圖1，批次1與批次2沒有顯著差異，見圖2，經(jīng)過計(jì)算可知多次測(cè)量的K值符合正態(tài)分布，其中ρ=0.181，μ=3.3488，所以，根據(jù)置信區(qū)間[μ-3ρ,μ+3ρ]，得到柵藻K值范圍為2.81～3.89。

表1 不同日期柵藻延遲發(fā)光K值對(duì)比

圖2第41～60d不同批次柵藻激發(fā)延遲發(fā)光的平均強(qiáng)度對(duì)測(cè)量時(shí)間的線性擬合斜率K值比較

Fig.2Comparison of theK-value of different Scenedesmuscerevisiae batches on the41st to60th day

4.2 方法學(xué)考察

4.2.1儀器背景噪聲 在實(shí)驗(yàn)前后分別檢測(cè)儀器噪聲發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)后的系統(tǒng)噪聲比實(shí)驗(yàn)前的略小，實(shí)驗(yàn)前噪聲平均值為10.68，實(shí)驗(yàn)后噪聲平均值為10.04，相差不到1個(gè)光子，t檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖3，因此認(rèn)為儀器系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

圖3 連續(xù)10 d實(shí)驗(yàn)前后儀器系統(tǒng)噪聲對(duì)比

4.2.2精密度實(shí)驗(yàn) 本研究測(cè)定了7次同一黃芩煎煮液的激發(fā)延遲發(fā)光的平均強(qiáng)度對(duì)測(cè)量時(shí)間的線行擬合斜率K，見表2，經(jīng)計(jì)算其RSD≈3.78%。因?yàn)镽SD<4%，故該檢測(cè)方法符合精密度要求。

表2 同一黃芩煎煮液擬合斜率KTable 2 The fitting slope K-value of the same scutellaria decoction

4.2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱量相同批次的黃芩10 g，連續(xù)7 d對(duì)其煎煮液進(jìn)行測(cè)定激發(fā)延遲發(fā)光的平均強(qiáng)度對(duì)測(cè)量時(shí)間的線行擬合斜率K，見表3。對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，7次K值得出的RSD ≈ 3.835% ，因RSD < 8%，故該檢測(cè)方法符合重復(fù)性要求。

表3 同一批次黃芩煎煮液連續(xù)7 d的擬合斜率K

4.2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 表4給出了生長階段的柵藻在0、4、8、12、24、48 h的7次激發(fā)延遲發(fā)光的平均強(qiáng)度對(duì)測(cè)量時(shí)間的線行擬合斜率K，經(jīng)過計(jì)算發(fā)現(xiàn)RSD ≈ 2.845%， 因RSD < 4%，故該檢測(cè)方法符合穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

表4 不同時(shí)間段激發(fā)延遲發(fā)光的平均強(qiáng)度對(duì)測(cè)量時(shí)間的先行擬合斜率K

4.2.5空白實(shí)驗(yàn) 為了避免中藥煎煮液中的溶劑水對(duì)柵藻K值的影響，我們將加入空白溶劑水的柵藻作為對(duì)照組，將加入BG11培養(yǎng)基的柵藻作為空白組進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組與空白組之間無顯著性差異(P>0.05)，見圖4，說明了中藥煎煮液中的溶劑水并不影響中藥的藥性檢測(cè)。

圖4 空白溶劑 ( H2O ) 與BG11的K值對(duì)比

5 結(jié)論

中藥藥性是中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論的重要組成內(nèi)容，建立符合現(xiàn)代科學(xué)認(rèn)知規(guī)律的中藥藥性表征體系及其規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)是中藥藥性理論研究的關(guān)鍵科學(xué)問題，而寒熱溫涼四性是藥性理論研究的重點(diǎn)之一[15]。基于生物光子相干性理論與中醫(yī)藥理論具有共同特征[16]，我們建立了以柵藻激發(fā)延遲發(fā)光的平均強(qiáng)度對(duì)測(cè)量時(shí)間的線性擬合斜率K定量化表征中藥藥性這一方法，符合中醫(yī)整體觀。

本研究進(jìn)行了以柵藻作為生物指示劑表征中藥藥性的方法學(xué)驗(yàn)證，探討了其儀器背景噪聲、精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，并進(jìn)行了空白實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了柵藻的使用條件，獲得了柵藻K值的正常波動(dòng)范圍為2.81～3.89，儀器適應(yīng)性良好，連續(xù)10 d檢測(cè)結(jié)果并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，精密度實(shí)驗(yàn)RSD≈3.78% < 4%，重復(fù)性RSD≈3.835%<8%，穩(wěn)定性RSD≈2.845%<4%。因此，柵藻激發(fā)延遲發(fā)光的平均強(qiáng)度對(duì)測(cè)量時(shí)間的線性擬合斜率K定量化表征中藥藥性這一方法是符合方法學(xué)驗(yàn)證要求。本研究建立的方法為中藥藥性的定量化研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。