催化劑用量與反應時間對乙交酯-丙交酯5050共聚物微結構的影響*

董浩，馬麗霞，吳倩倩，王憲朋，朱愛臣，李文明，王勤，王傳棟，劉陽

(山東省藥學科學院 山東省醫(yī)用高分子材料重點實驗室，濟南 250101)

1 引 言

緩釋藥物制劑主要包括植入體、微球、膜劑、凝膠、脂質體等，其中長效緩釋微球因具有可靶向性、藥物穩(wěn)定性高、緩釋周期長等特點，一直是各國學者的研究熱點[1]。該微球制劑采用乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)為載體，藥物釋放周期可達2周、4周、8周或更長，緩釋對象以多肽、蛋白類及部分小分子化學藥物為主[2-3]，臨床上多用于治療腫瘤、精神障礙、退化性病變等疾病[4-6]。PLGA作為微球制劑的載體，在國內雖已載入藥典，但主要關注于特性粘度、共聚物組成、分子量及其分布等性能指標[7]，而聚合物鏈段長度及分布等微結構對載體性能和緩釋效果的影響未見報道。經研究發(fā)現，鏈段序列長度，尤其是乙交酯序列長度(LGG)影響聚合物降解速率和溶解性，進而影響制劑工藝和藥物釋放情況[8-9]。當LGG<3時，聚合物降解速度較快，部分藥物突釋現象明顯，而當LGG>5時，聚合物在絕大部分有機溶劑中溶解性變差，嚴重妨礙制劑制備工藝研究。為此，對PLGA5050在聚合過程中發(fā)生的二級酯交換反應與共聚物微結構之間的關系進行了研究，通過改變催化劑用量與反應時間，研究其對聚合過程中的二級酯交換反應的影響和對共聚物微結構產生的影響，以求將LGG控制在合理范圍，從而控制整個聚合物的降解速率和溶解性，滿足長效緩釋微球的藥物釋放要求。

2 實驗部分

2.1 原料和試劑

丙交酯(LA)，純度99.5%，自制；乙交酯(GA)，純度99.5%，自制；辛酸亞錫，分析純，Sigma公司；氯仿，色譜純，美國JT. Baker公司；乙醇，分析純，天津市百世化工有限公司；二氯甲烷，分析純，天津市百世化工有限公司。

2.2 共聚物的合成

準確稱量摩爾比為1∶1的丙交酯和乙交酯加入反應瓶中，依次加入一定量的辛酸亞錫和十二醇為催化劑和引發(fā)劑，在真空條件下，150℃開環(huán)聚合反應一定時間后得到聚合物，產物用二氯甲烷溶解，乙醇沉淀純化，經真空干燥后，得到一系列PLGA5050共聚物固體。

2.3 表征與測試

1H-NMR和13C-NMR表征：采用德國Bruker公司 Avance 400 MHz型核磁共振儀，以氘代六氟異丙醇為溶劑，TMS為內標，測定共聚物的1H-NMR和13C-NMR。

GPC表征：采用美國Waters 凝膠滲透色譜儀(Waters 2414檢測器，Waters1515泵，Waters 2707自動進樣器)，以氯仿為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，聚苯乙烯(PS)為標準樣，對聚合物的數均分子量(Mn)及其分布(Mw/Mn)進行表征。

3 結果與討論

3.1 催化劑用量與反應時間對聚合反應的影響

以常用的辛酸亞錫為催化劑，用量分別為0.05%、0.2%、0.5%(w/w)，在150℃、70 Pa的條件下，控制不同反應時間，得到一系列PLGA5050共聚物。共聚物的1H-NMR見圖1，δ1.5～1.7 ppm為丙交酯單元的甲基質子(CH3)特征峰；δ4.6～5.0 ppm 為乙交酯單元的亞甲基質子(CH2)特征峰；δ5.1～5.4 ppm區(qū)域為丙交酯單元中的次甲基質子(CH)特征峰。根據丙交酯單元上的次甲基和乙交酯單元上的亞甲基的質子共振峰積分面積計算共聚物各組分含量，并考察其顏色、溶解性、收率、分子量及其分布等變化情況，結果見表1。

圖1 PLGA5050共聚物1H-NMR圖

由表1可以看出，對于相同催化劑用量，隨著反應時間延長，聚合產物顏色均逐漸加深，在氯仿中的溶解性逐漸變好。與此同時，隨著催化劑用量的增加，對于同樣的反應時間，聚合物的顏色和溶解性顯示出相同的現象。溶解性是影響聚合物應用于緩釋藥物載體的重要因素，我們推測這可能與聚合物的微結構，尤其是乙交酯鏈段的平均序列長度LGG有關。

由表1還可看出，共聚物中乙交酯組分摩爾含量均在50%左右，與投料摩爾含量基本一致。而且，可溶于氯仿的聚合物數均分子量(Mn)均達到40 000～55 000，分子量分布較窄，分布系數(Mw/Mn)均在1.5～1.7，聚合物收率均在90%以上。說明聚合過程中丙交酯和乙交酯的聚合速率雖然不同，但聚合時間較長，兩者的開環(huán)聚合反應較完全，共聚單體均參與了聚合反應并加入到聚合物鏈中，共聚物分子量分布較為均勻。

表1 催化劑用量與反應時間對PLGA5050共聚物性能的影響

注：對于氯仿中不溶的共聚物，無法測定分子量及其分布。

3.2 PLGA5050共聚物微結構表征

丙交酯(LA)和乙交酯(GA)在聚合時發(fā)生的酯交換反應有兩種模式[10]，一種是發(fā)生在-LL-單元(L表示乳酰結構單元(-CH(CH3)COO-))和-GG-單元(G表示乙酰結構單元(-CH2COO-))或它們多重單元之間的酯交換，即一級酯交換，其結果是聚合物鏈增長；另一種是上述單元或多重單元發(fā)生斷裂重排，即發(fā)生二級酯交換，其結果是形成-LGL-或-GLG-序列結構，以及-LGGGL-和-GLLLG-及其它微結構中具有奇數L或奇數G單元的序列結構[11-13]。將1H-NMR圖中乙交酯序列結構的亞甲基質子(CH2)特征峰進行歸屬[11-13]，見圖2和表2。

L和G結構單元由于酯交換后所處微結構的化學環(huán)境不同，其特征峰在核磁譜圖中表現出相應的化學位移變化。將13C-NMR圖中L單元和G單元的酯羰基碳的共振峰進行歸屬[11-13]，見圖3。可見PLGA5050共聚物的L結構單元中的酯羰基碳共振峰附近均可觀察到-GLG-序列所對應的共振峰。

圖2 PLGA5050共聚物中的乙交酯亞甲基質子1H-NMR圖

表2 PLGA5050共聚物1H-NMR圖中乙交酯序列特征峰歸屬表

圖3PLGA5050共聚物中的酯羰基碳13C-NMR圖

Fig.3Carbonyl signalsin13C-NMR spectra of PLGA5050copolymer

3.3 催化劑用量與反應時間對聚合過程中二級酯交換的影響

PLGA共聚物中-GG-單元的二級酯交換系數TⅡ[LGL]和-LL-單元的二級酯交換系數TⅡ[GLG]可按以下公式計算[11-13]：

TⅡ[LGL]=[LGL]/[LGL]R

(1)

TⅡ[GLG]=[GLG]/[GLG]R

(2)

式中的[LGL]和[GLG]分別為共聚物中LGL和GLG序列的實際相對分數，通過核磁積分面積計算。[LGL]R和[GLG]R可按Bernoulian公式計算得到的兩個序列的理論相對分數：

[LGL]R=k/(k+1)3

(3)

[GLG]R=k2/(k+1)3

(4)

式中的k=[G]/[L]分別是共聚物中-G-和-L-結構單元的分數，是根據1H-NMR譜中-L-單元上的次甲基質子(CH)和-G-單元上的亞甲基質子(CH2)的共振峰積分面積計算的。根據式(1)和式(2)計算的PLGA共聚物的二級酯交換系數見表3。

由表3可以看出，在相同催化劑用量條件下，共聚物的TⅡ[GLG]和TⅡ[LGL]均呈現隨反應時間的延長而增大的趨勢；而在相同反應時間時，催化劑用量越大，共聚物二級酯交換系數越大，說明共聚過程中發(fā)生了明顯的酯交換反應，導致序列結構重新分布，隨著反應時間延長，二級酯交換反應的發(fā)生使-LL-或-GG-單元及其多重單元發(fā)生斷裂，形成更多的-GLG-和-LGL-序列結構。而催化劑的引入加速了單體開環(huán)聚合的反應速率，進而加速了二級酯交換反應的速率，使-GLG-和-LGL-序列結構增多，這與辛酸亞錫催化劑作為共引發(fā)劑引發(fā)丙交酯乙交酯開環(huán)聚合的機理一致[10]。

由表3還可以看出，同一樣品的TⅡ[LGL]顯著小于TⅡ[GLG]，說明聚合過程中-LL-單元的二級酯交換反應比-GG-單元的二級酯交換反應顯著。由于GA的聚合速率遠大于LA，反應過程中首先是GA與GA反應生成較長的-GG-結構序列，聚合體系中GA的濃度不斷下降，而LA的濃度相比GA較大，在LA與LA及LA與-GG-單元反應的同時，生成的-LL-序列與-GG-單元發(fā)生分子間的二級酯交換反應的幾率增大，從而形成較多的-GLG-序列結構。

3.4 催化劑用量與反應時間對共聚物平均序列長度的影響

PLGA共聚物分子鏈中-LL-和-GG-序列的平均長度可根據以下公式計算：

LLL=ILL/ILG+ 1 (5)

LGG=IGG/IGL+ 1 (6)

表3 催化劑用量與反應時間對PLGA5050共聚物二級酯交換的影響

式中的ILL、ILG、IGG和IGL分別對應LLLL、LLGG、GGGG和GGLL單元13C-NMR共振峰(見圖4)的積分強度。

由圖4可以看出，隨著反應時間的延長，ILG逐漸增大，與ILL的差距逐漸縮小，直至120 h與ILL較接近，同樣，IGL與IGG的差距隨時間的延長逐漸減小，最后趨于接近。根據式(5)和式(6)計算的平均序列長度LLL和LGG見表4。

由表4可以看出，隨著反應時間的延長，共聚物-LL-和-GG-序列的平均長度均逐漸減小，LLL由4逐漸減至2左右，LGG也由5逐漸減至2左右，說明聚合過程中共聚物分子鏈由微嵌段向無規(guī)的方向轉變(無規(guī)共聚物LLL=2，LGG=2)，這可能是因為GA與LA聚合速率的差異造成了-GG-單元微嵌段結構首先生成，隨后-LL-單元微嵌段也逐漸形成，隨著聚合過程中發(fā)生的二級酯交換反應，使-GG-或-LL-單元及其多重單元發(fā)生斷裂，形成更多的-GLG-和-LGL-序列結構，共聚物分子鏈的微嵌段逐漸減少，而表現出無規(guī)分布的特點。這與前述的聚合過程中逐漸增加的二級酯交換反應規(guī)律相一致。

圖4 不同反應時間PLGA5050共聚物酯羰基碳13C-NMR圖

表4 催化劑用量與反應時間對PLGA5050共聚物平均序列長度的影響

見圖5，不同催化劑用量條件下，共聚物乙交酯鏈段序列長度(LGG)隨反應時間均逐漸減小，并最終趨于穩(wěn)定(LGG=2.2～2.5)，聚合物嵌段性逐漸降低，這也與它們在氯仿中的溶解性變化規(guī)律一致，見表1。而且，隨催化劑用量增多，在相同的反應時間條件下，LGG下降顯著，如聚合反應達12 h，催化劑用量由0.05%增加到0.2%，LGG下降了22.3%，用量增加到0.5%時，LGG下降了32.7%，顯示出聚合物嵌段性明顯降低。

由表4和圖5可以看出，三種催化劑用量均得到了LGG為3～5之間的聚合物，然而催化劑用量較少時，反應更為溫和，反應時間的可調控范圍更大，更容易合成LGG為3～5之間的微嵌段聚合物。

圖5 乙交酯鏈段平均序列長度(LGG)隨反應條件變化曲線圖

4 結論

本研究以辛酸亞錫為催化劑，采用本體開環(huán)聚合法制備了一系列PLGA5050共聚物，研究了不同催化劑用量和不同反應時間對共聚物微結構的影響，結果表明：

(1)共聚物組成與投料摩爾比基本一致，共聚物數均分子量40 000～55 000，分子量分布較為均勻，分布系數(Mw/Mn)均在1.5～1.7，收率>90%。

(2)隨著反應時間延長和催化劑用量增多，聚合過程中的二級酯交換反應明顯，導致形成更多的-GLG-和-LGL-序列結構。

(3)隨著反應時間延長和催化劑用量增多，共聚物的平均序列長度(LLL或LGG)逐漸減小，催化劑用量較高時，減小更為顯著，共聚物由微嵌段向無規(guī)結構的方向轉變。

(4)不同催化劑用量條件下，均可得到LGG為3～5之間的聚合物，當催化劑用量為0.05%時，反應速度更溫和，反應時間范圍更大，更有利于LGG為3～5的PLGA5050微嵌段共聚物的合成。