基于STM32芯片的腫瘤細胞熒光檢測系統設計*

紀春陽， 徐秀林

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海 200093)

1 引 言

惡性腫瘤是目前嚴重威脅人類健康和生命的疾病之一[1]，全球癌癥的新發病例預計在2030 年將增加到 2 220萬例[2-3]。近年來, 隨著醫療技術的不斷突破，癌癥死亡率保持了逐年下降的趨勢[4-5]，這與對癌癥的早期檢測意識的提高是密切相關的。

通過早期篩查診斷，能顯著增加癌癥治愈的機會。目前臨床上常用的檢查方法是活體組織檢查及影像學篩查，前者常常花費大量的時間和經濟成本，而影像學檢查的準確性會受到圖像質量和放射科醫師專業知識的影響[6-7]，使得患者常常錯過最佳治療時間。因此，如何將現代科學技術的研究成果與醫學檢查和診斷有效結合，是研究人員急待解決的問題。

2 系統整體結構設計與實現

本研究開發了一種基于微流控芯片的腫瘤細胞熒光檢測系統，下位機電路由STM32芯片及外圍電路組成，上位機軟件系統基于VC++平臺搭建。微流控芯片(見圖1)的基本結構由玻璃基板與PDMS(聚二甲基硅氧烷)層組成[8]，可實現對樣本血液中的腫瘤、紅、白細胞的分選[9-10]，本研究使用的芯片內部管道寬度為340 μm、高度為100 μm，借助微流控芯片精密微通道使腫瘤細胞依次流過檢測區域。

2.1 光路結構設計

本研究的光路結構采用反射式共焦距結構，選擇光強可調式LED作為激發光源。激發光先由濾光片進行固定波長篩選，再由透鏡對其進行初次聚焦，二向色鏡起到了折射的作用，使激發光充分地投射到待檢測物上。當入射光照射在被熒光染料標記的腫瘤細胞時，使細胞表面的熒光素中，原本處于基態的原子向激發態進行躍遷，產生比入射光波長更長的熒光，激發光最終被光電探測器采集。光路示意圖見圖2(a)，光路實物圖見圖2(b)。

圖1 微流控芯片

圖2檢測系統光路結構

(a).光路示意圖;(b).光路實物圖

Fig.2Optical path structure of detection system

(a).optical path diagram;(b).optical path physical map

2.2 電路設計

圖3電路結構圖

Fig.3Circuit structure diagram

2.3 軟件設計

為使檢測系統實現可視化與檢測結果的錄入，本研究同時設計了一套基于VS2015平臺、Duilib框架的可視化軟件系統。軟件系統由患者信息管理模塊、腫瘤細胞檢測模塊和打印報告模塊組成。

患者信息管理模塊的功能包括：患者信息錄入、查看、修改、刪除；腫瘤細胞檢測模塊將下位機采集到的數據，經處理之后進行顯示、并繪制成曲線圖，以便直觀地觀測腫瘤細胞的檢出率及統計結果。最后將操作人員、患者信息、檢測時長、腫瘤細胞數量統計后打印病理報告，以輔助醫生診斷。

3 細胞熒光信號采集與電路設計

3.1 光電轉換模塊

光電倍增管(PMT)通常用于捕捉微弱發射源產生的低光信號，在本研究中，PMT用于探測被熒光標記的腫瘤細胞所激發的微弱熒光信號。在型號選擇方面，參照了光譜響應范圍、光輻射靈敏度、噪聲、陽極脈沖上升時間等技術參數，選擇索雷博公司生產的PMT1002光電倍增管模塊。該型號探測器響應光輻射響應頻段為(230～920) nm，并在630 nm處達到峰值。噪聲在0.6 mV左右，該模塊在響應時輸出在(-1.5～+1.5) V，可將該微弱噪聲忽略不計。陽極脈沖上升時間為0.57 ns，可適用于常規檢測平臺的高速細胞流道，有效避免細胞漏檢等情況的發生。光電轉換模塊內部結構見圖4。

圖4 光電轉換模塊內部結構圖

Fig.4Internal structure diagram of photoelectric conversion module

3.2 STM32F103C8T6芯片

STM32主控模塊采用32位微處理器芯片STM32F103C8T6，ARM Cortex-M3內核作為中央控制芯片。在額定工作狀態下，該芯片具有超過80個高速GPIO口對電壓和電流分辨率分別為0.8 mV和1 nA，內置I2C通訊接口實現了與A/D芯片通信橋梁，并且與上位機通信使用的串口最高傳輸速度可達4.5 Mbps，可滿足腫瘤細胞熒光檢測的準確性與實時性要求。

3.3 A/D轉換

ADS1115是一款兼容I2C的16位高精度低功耗的數模轉換器。該芯片最高轉換速率達到每秒860個數據，并且該芯片內置了多路復用器 (MUX)，實現兩次差動輸入測量或四次單端輸入測量。

A/D轉換過程如下：

芯片首先上電并初始化，在接收模式下，收到主機發送的第一個8位start指令后，將R/W位置0進入寫模式，配置指定寄存器并應答轉換寄存器的LSB、MSB。執行確認指令(ACK)，當指令通過完整性檢查后，對寄存器地址指針進行解碼，芯片進入待機狀態，等待主機下一次start指令。

A/D芯片確認寄存器位置后將數據寫入。如果待讀取寄存器不是剛剛完成寫入的寄存器，則需對下一次指令中地址指針的數值進行修改。

本文認為，不同程序中不同的價值導向在起最終的作用。在專利授權程序中，權利要求理解的價值導向在于：促使專利申請人修改申請文件從而以更加明確的措辭或術語來限定其保護范圍。在專利確權程序中，權利要求理解的價值導向在于：既要考慮授權權利要求的公示作用，又要考慮其實際技術貢獻，從而更好地在保護專利權人的創新與由權利要求公示作用所體現的保障公眾合法權益之間維持平衡。在專利民事侵權程序中，權利要求解釋的價值導向在于：對一項具有技術貢獻的發明匹配合理的保護范圍從而作出侵權與否的判斷。不同的價值導向使得不同程序中權利要求保護范圍的理解和解釋的基本規則不盡相同。

接收到主機發送start指令后，將R/W位置1進入讀模式，依次讀取數據的高八位與低八位，并將高位右移八位組成16位的數據結果。此時一次轉換完成。A/D轉換電路見圖5。

圖5A/D轉換電路圖

Fig.5A/D conversion circuit diagram

3.4 串口通訊模塊

串口模塊核心結構由平衡驅動器和差分接收器構成，使其數據最高傳送速率達到10 Mbps且具有抗噪聲、高共模抑制比的特點。但其接口處易產生電流震蕩，需外接電壓調置電路才能使其穩定工作。

本研究使用美信公司生產的MAX232芯片作為電壓調置電路的核心器件，+5 V循環充電的外接電容用于穩定輸出電壓。串口通訊電路見圖6。

圖6 串口通訊電路圖

Fig.6Serial communication circuit diagram

3.5 供電模塊

供電芯片選擇ASM1117-3.3 V和ASM1117-5.0 V兩種，二者均由奧地利微電子公司生產。該穩壓芯片在-40～125℃時可保持正常工作，滿足設備在長時間與非常溫環境下的細胞檢測需要，并且其輸出電壓誤差不超過1%。

在實際工作中，輸入電源通常夾雜一些高低頻干擾。為消除噪音影響，在芯片輸入、輸出端并聯兩個47 uf電解電容與0.1 uf瓷片電容。前者具有大容量、高交流阻抗的特點，但其對高頻噪聲抑制效果不明顯，而后者高頻特性好、容量較小，為更好地消除高低頻噪聲與降低ESL(串聯等效電感)、ESR(串聯等效電阻)，將二者搭配使用，使電路系統處于更加穩定的工作狀態。供電模塊見圖7。

圖7 供電模塊電路圖

4 系統軟件設計

4.1 患者信息管理模塊

患者信息管理模塊采用VC++開發，數據庫為Microsoft關系型數據庫sql server 2005，可將數據文件、數據日志進行簡單加密，對患者隱私、診療方案進行保密處理。使用ado的方式連接到VC++，實現了對患者信息數據的跨平臺調用。

在VC++開發環境中，首先新建用于鏈接ado的類，將生成的頭文件adosql.h、源文件adosql.cpp、msado15.dll動態鏈接庫導入到主程序中。創建指向數據庫的指針(m_pConnection)，初始化指針使其指向SQL數據庫中的患者信息表(paient)。為了跨平臺對數據的讀取與修改，將許可權參數設置為默認狀態(adModeUnknown)。

4.2 報告打印模塊

本研究的報表使用書簽與光標混合的形式進行編輯，有效避免串位、亂碼等情況的發生。導入word類庫，從office 2016安裝路徑中找到MSWORD.OLB文件，導入_Application、 _Document、Range、Cell等類。為方便在軟件系統中實現報表生成，提前在word中創建好一個模板，并在需要填入、更新的位置插入書簽。系統使用OLE技術(對象連接與嵌入)實現了對Word文檔連接。報告打印預覽見圖8。

圖8 報告打印預覽圖

5 實驗分析

將異硫氰酸熒光素(FITC)[11-12]對人乳腺導管癌細胞系MDA-MB-453進行熒光標記，每次實驗取5 mL濃度為1×102Cell /mL的細胞溶液作為試驗的樣品。為確保FITC染色效果的穩定性與有效性，實驗前在熒光顯微鏡下觀察激發熒光效果。圖9為 FITC 熒光標記后的MDA-MB-453 細胞懸浮液的熒光激發效果圖。為驗證采集熒光標記細胞的準確計數功能與探究不同進樣速度對檢出率的影響，將磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)與不同進樣速度作為實驗對照組。打開光源、檢測電路、光電倍增管上電并將微流控芯片放置在光探頭檢測窗口區域。設置好檢測參數后，微量進樣注射泵將樣品以4、6、8 mL/h的速度將細胞液注射入微流控芯片中。為驗證該檢測系統的穩定性，在第一組實驗結束后，間隔3 d后按照以上步驟重復進行實驗。本實驗共進行2組實驗，為避免重復性實驗中的干擾，在每次實驗結束后，使用PBS緩沖液反復對微流控芯片進行清洗，確保無殘留腫瘤細胞。實驗結果見表1。

表1 腫瘤細胞檢出率結果

檢出率為實際被檢出的細胞數量與應該被檢出的細胞個數的比值。由實驗結果可知，各組平均檢出率為85.36%、85.85%、85.65%、85.06%、70.56%、71.68%，且組內相關系數均高于0.80。對照組實驗結果表明，在保證檢測精度的同時，最大地提升檢測速度，可將進樣速度設置為6 mL/h。

圖9FITC染色 MDA-MB-453激發效果圖

Fig9Excitation effect of FITC dyeing MDA-MB-453

6 結論

本研究開發了一種基于微流控芯片的腫瘤細胞熒光檢測系統。該系統的光路結構采用反射式共焦距結構，有效利用激發光源的同時降低雜散光的影響；光電探測器內置跨阻放大器與DAC調制的光電探測器精準探測與采集熒光信號；A/D高精度數模轉換器ADS1115在高效轉換模擬信號的同時，也對其進行降功耗處理；在多個供電處外接電解電容與瓷片電容，以消除高低頻噪聲，使電路系統處于穩定的工作狀態。

但本研究還存在以下不足之處：當光電探測器探頭與待檢細胞的距離產生微小變化時，便會對檢測結果產生較大影響。本研究中的光學檢測平臺為手動調節結構，應設計成固定結構或添加鏡頭位移調整裝置，使每次工作時，光電探頭自動移動到固定檢測位置。因腫瘤患者血液樣本獲取難度較大，同時血液中成分復雜，本研究使用稀釋過的人乳腺導管癌細胞系MDA-MB-453溶液作為模擬血液。為了進一步驗證本研究的可靠性，應使用腫瘤患者循環血作為研究樣品。本研究中樣品熒光標記方式為免疫熒光標記，即抗原抗體反應，但在研究過程中，被標記的腫瘤細胞經微流控芯片離心、富集、篩選過后，表面抗原的脫落現象會對研究結果產生影響，因此可改為熒光酶標記質粒法。