金屬離子對(duì)嗜油不動(dòng)桿菌YT03 降解亞硝酸鹽的影響

李彬，呂冉，肖盈，張靖雯，麥裕良，林藍(lán)

（廣東省石油與精細(xì)化工研究院，廣東省工業(yè)表面活性劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510665）

人工配合飼料的投喂以及魚(yú)、蝦代謝產(chǎn)物的積累，常會(huì)造成含氮化合物在養(yǎng)殖水體中的大量積累，而一些形態(tài)的氮又可通過(guò)微生物的作用轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽[1]。養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的不斷積累，滲透吸收進(jìn)入水產(chǎn)動(dòng)物的血液，與血紅蛋白結(jié)合使其失去攜氧能力，極大危害魚(yú)、蝦等，導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物缺氧、昏迷甚至死亡；動(dòng)物長(zhǎng)期生活在亞硝酸鹽含量偏高的水體中，免疫力下降，極易感染病原而暴發(fā)疾病[2,3]。

反硝化菌可將養(yǎng)殖水體中積累的亞硝酸鹽還原為含氮的氣體從水中釋放出來(lái)，去除水體中的含氮污染物[4,5]。相對(duì)于傳統(tǒng)的厭氧反硝化菌，好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)，使得微生物法脫氮過(guò)程的硝化、反硝化兩個(gè)階段能在好氧條件下同時(shí)進(jìn)行，簡(jiǎn)化生物脫氮工藝，降低生產(chǎn)成本，具有較好的工業(yè)化應(yīng)用前景[6,7]。

好氧反硝化菌生長(zhǎng)代謝需要多種金屬元素。Mg、Mn、Cu、Co 和Zn 是生物酶的組分或輔助因子[8]；Fe 存在于細(xì)胞色素、鐵氧還蛋白和鐵硫蛋白中，是氧化還原的載體和多種酶合成的必需元素[9]；Ca 在細(xì)菌的運(yùn)輸系統(tǒng)和滲透平衡中起重要作用，有利于穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[8]；Mo 是硝酸鹽還原酶等的輔助因子[10]。然而，金屬元素過(guò)量則可能與蛋白質(zhì)、氨基酸和核酸等結(jié)合生成金屬絡(luò)合物或螯合物，抑制新陳代謝，導(dǎo)致細(xì)菌中毒甚至死亡[9,11]。金屬元素對(duì)好氧反硝化菌的作用也與細(xì)菌自身特性有關(guān)，不同細(xì)菌所需金屬元素的種類(lèi)及適宜用量不盡相同。因此，系統(tǒng)研究（離子形式存在的）金屬元素對(duì)好氧反硝化菌YT03 的影響意義重大。

目前，關(guān)于金屬離子對(duì)好氧反硝化菌影響的研究較少。本實(shí)驗(yàn)室從生活污水中分離篩選出一株嗜油不動(dòng)桿菌Acinetobacter oleivorans YT03，可通過(guò)好氧反硝化作用高效降解亞硝酸鹽，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但目前金屬離子對(duì)該菌株生長(zhǎng)和凈化亞硝酸鹽的影響尚不明確。因此，本文通過(guò)研究多種金屬離子對(duì)嗜油不動(dòng)桿菌YT03 的生長(zhǎng)和凈化亞硝酸鹽效果的影響，對(duì)優(yōu)化YT03 菌培養(yǎng)基配方，加深了解其特性，探討金屬離子對(duì)好氧反硝化菌降解亞硝酸鹽的影響機(jī)理，促進(jìn)其在處理養(yǎng)殖污水中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)用嗜油不動(dòng)桿菌YT03 由廣東省石油與精細(xì)化工研究院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

亞硝酸鹽好氧反硝化培養(yǎng)液：0.05g·L-1NaNO2，0.54g·L-1丁二酸鈉，0.33g·L-1K2HPO4·3H2O，0.13g·L-1NaCl，以及少量或微量金屬離子溶液，金屬離子的組成及用量見(jiàn)1.2。

1.2 方法

1.2.1 金屬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

根據(jù)文獻(xiàn)[2,12,13]及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)液中各金屬離子添加的質(zhì)量濃度范圍（表1），預(yù)先配制質(zhì)量濃度為0.1g·L-1、1g·L-1或10g·L-1的金屬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液。依金屬離子對(duì)應(yīng)的濃度梯度，確定標(biāo)準(zhǔn)溶液在好氧反硝化培養(yǎng)液中的體積用量。

1.2.2 好氧反硝化培養(yǎng)液的配制

參照1.1 配制含不同質(zhì)量濃度金屬離子（表1）的好氧反硝化培養(yǎng)液，一種金屬離子質(zhì)量濃度按梯度變化的同時(shí)其他金屬離子質(zhì)量濃度保持不變。用10%鹽酸溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH 至7.2。配制好的各培養(yǎng)液（100mL）移入250mL 三角瓶中，按金屬離子濃度梯度分別編號(hào)1～5。三角瓶用四層紗布外加一層牛皮紙包扎封口，保證瓶?jī)?nèi)與外界的空氣相通，為YT03 菌提供充足氧氣。每個(gè)濃度梯度均設(shè)三個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)液經(jīng)121℃高溫濕熱滅菌處理20min 后備用。

Mg2+、Ca2+、Mn2+和Fe2+等金屬離子在好氧反硝化培養(yǎng)基中較為普遍[14-16]，為保證YT03 菌較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，在不同金屬離子對(duì)YT03 菌的影響研究中，除待研究的金屬離子按表1 中相應(yīng)濃度梯度添加外，培養(yǎng)液中Mg2+、Ca2+、Mn2+和Fe2+四種金屬離子如需保持恒定則其添加濃度均按表1 中的濃度梯度3添加，不添加其余金屬離子。

表1 YT03 菌培養(yǎng)液中添加的不同金屬離子及其質(zhì)量濃度Tab.1 Different metal ion types and concentrations added in culture medium of bacterium YT03

實(shí)驗(yàn)所用含鉬化合物（NH4）6Mo7O24·4H2O[16]在水溶液中解離產(chǎn)生NH4+，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，氨氮也可作為唯一氮源被實(shí)驗(yàn)用好氧反硝化菌YT03 所利用。為排除氨氮的影響，在配制含不同質(zhì)量濃度的Mo6+的培養(yǎng)液時(shí)，以1000 mg·L-1硫酸銨溶液調(diào)節(jié)使各培養(yǎng)液的氨氮濃度一致。

1.2.3 金屬離子對(duì)YT03 菌的影響試驗(yàn)

將-20℃甘油保存的YT03 菌液（菌液與40%甘油體積比為1∶1），以1%接種量分別接種至含不同質(zhì)量濃度金屬離子的好氧反硝化培養(yǎng)液中，在溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速150r·min-1條件下培養(yǎng)6h，分別取樣測(cè)定培養(yǎng)液的OD600，檢測(cè)培養(yǎng)液中亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度，計(jì)算亞硝酸鹽氮的去除率。亞硝酸鹽氮去除率計(jì)算公式：其中，c0和c1分別為接種YT03 菌后0h 和培養(yǎng)6h后取樣測(cè)得的培養(yǎng)液中亞硝酸鹽氮的濃度，單位mg NO2--N·L-1。

1.3 分析方法

YT03 菌生長(zhǎng)密度OD600采用分光光度法測(cè)定[6]。亞硝酸鹽氮NO2-N 質(zhì)量濃度采用重氮化偶合分光光度法[17]測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)差異顯著時(shí)，再做Duncan's 多重比較進(jìn)行組間顯著性差異的兩兩比較，顯著水平P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mg2+對(duì)YT03 菌生長(zhǎng)和降解亞硝酸鹽的影響

Mg2+對(duì)YT03 菌降解亞硝酸鹽和生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1（a）和（b）。對(duì)照組中，Mg2+添加濃度為0mg·L-1，YT03 菌對(duì)亞硝酸鹽的降解率為42.77%。隨著Mg2+添加濃度增加，亞硝酸鹽降解率隨之增長(zhǎng)，Mg2+濃度為18.48mg·L-1時(shí)，亞硝酸鹽降解率為53.54%（對(duì)照組的1.25 倍），顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。當(dāng)Mg2+濃度繼續(xù)增加，亞硝酸鹽降解率增長(zhǎng)不顯著（P＞0.05）；OD600由對(duì)照組的0.072 增至Mg2+添加濃度6.16mg·L-1時(shí)的0.082，此后隨著Mg2+添加濃度繼續(xù)增加，OD600變化不顯著（P＞0.05）。在YT03 菌降解亞硝酸鹽過(guò)程中，優(yōu)選的Mg2+添加濃度為18.48mg·L-1。

2.2 Ca2+對(duì)YT03 菌生長(zhǎng)和降解亞硝酸鹽的影響

由圖2 可知，隨Ca2+添加濃度的增加，YT03 菌對(duì)亞硝酸鹽的降解率增加，Ca2+添加濃度最高為7.22 mg·L-1時(shí)，亞硝酸鹽降解率為49.39%，是對(duì)照組（Ca2+添加濃度為0mg·L-1）的1.23 倍，但Ca2+的添加對(duì)YT03 的亞硝酸鹽去除率沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。對(duì)照組YT03 菌的OD600為0.075，而添加Ca2+后（添加濃度為1.81～7.22 mg·L-1），OD600在0.082～0.090 范圍內(nèi)有所波動(dòng)。

2.3 Mn2+對(duì)YT03 菌生長(zhǎng)和降解亞硝酸鹽的影響

由圖3-a 可知，隨著Mn2+添加濃度由0 mg·L-1增加至0.65 mg·L-1，YT03 菌對(duì)亞硝酸鹽的降解率由40.99%增至47.71%（1.16 倍），顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。當(dāng)Mn2+添加濃度繼續(xù)提高至1.30 mg·L-1，亞硝酸鹽降解率變化不顯著（P＞0.05）。而OD600由0 mg·L-1Mn2+時(shí)的0.084 提高至1.30 mg·L-1Mn2+時(shí)的0.099，但差異不顯著（P＞0.05）（圖3-b）。Mn2+的優(yōu)選添加濃度為0.65 mg·L-1。

2.4 Fe2+對(duì)YT03 菌生長(zhǎng)和降解亞硝酸鹽的影響

從圖4-a 可知，添加0.50 mg·L-1Fe2+使亞硝酸鹽去除率顯著增加至50.73%，是未添加Fe2+組的4.93 倍（P＜0.05）。而隨Fe2+添加濃度繼續(xù)增加，亞硝酸鹽去除率變化不顯著（P＞0.05）。OD600由0 mg·L-1Fe2+時(shí)的0.027 顯著增加至0.25 mg·L-1Fe2+時(shí)的0.083（P＜0.05），當(dāng)Fe2+添加濃度繼續(xù)增加至1.00 mg·L-1Fe2+時(shí)，OD600為0.098，變化不顯著（P＞0.05）（圖4-b）。從YT03 對(duì)亞硝酸鹽的去除效果看，優(yōu)選的Fe2+添加濃度為0.50 mg·L-1。

2.5 Mo6+對(duì)YT03 菌生長(zhǎng)和降解亞硝酸鹽的影響

由圖5 可知，Mo6+對(duì)YT03 菌株的生長(zhǎng)和降解亞硝酸鹽的影響不顯著（P＞0.05），Mo6+添加濃度從0 mg·L-1增加至19.19 mg·L-1，YT03 菌的OD600（0.092～0.102）及亞硝酸鹽的去除率（24.53%～29.70%）有所波動(dòng)，而未見(jiàn)明顯促進(jìn)作用。

2.6 Zn2+對(duì)YT03 菌生長(zhǎng)和降解亞硝酸鹽的影響

由圖6-a 可知，添加0.51 mg·L-1Zn2+時(shí)亞硝酸鹽去除率顯著下降（P＜0.05），隨Zn2+添加濃度的增加，亞硝酸鹽去除率由未添加Zn2+時(shí)的54.16%顯著降低至添加2.05mg·L-1Zn2+時(shí)的23.04%（P＜0.05）。由圖6-b 可知，當(dāng)Zn2+添加濃度從0.51mg·L-1增至1.53mg·L-1時(shí)，OD600從0.075顯著降低至0.016（P＜0.05），1.53 mg·L-1與2.05mg·L-1濃度組差異不顯著（P＞0.05）。

2.7 Cu2+對(duì)YT03 菌生長(zhǎng)和降解亞硝酸鹽的影響

Cu2+添加濃度在0.06 mg·L-1以上時(shí)，YT03 菌的OD600和對(duì)亞硝酸鹽的去除率顯著下降（P＜0.05），最終分別由對(duì)照組（未添加Cu2+）的0.071 和59.93%降低至0.25 mg·L-1Cu2+時(shí)的0.050 和27.56%（圖7）。對(duì)于OD600和亞硝酸鹽去除率的變化，僅0.06mg·L-1與0.13 mg·L-1濃度組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.8 Co2+對(duì)YT03 菌生長(zhǎng)和降解亞硝酸鹽的影響

由圖8-a 可知，在Co2+添加濃度為0.05 mg·L-1時(shí)，YT03 菌對(duì)亞硝酸鹽的降解率顯著下降（P＜0.05），當(dāng)Co2+添加濃度繼續(xù)增加至0.20mg·L-1，亞硝酸鹽去除率顯著下降至10.53%（P＜0.05）。YT03菌的OD600由0mg·L-1Co2+時(shí)的0.091 顯著降低至0.15mg·L-1Co2+時(shí)的0.031（P＜0.05），而后緩慢降至0.20 mg·L-1Co2+時(shí)的0.028（P＞0.05）（圖8-b）。

3 討論

于大禹等[18]研究表明，1mmol·L-1Fe2+（相當(dāng)于55.85mg·L-1Fe2+）使異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌H1對(duì)模擬廢水中氨氮的去除率（48h）由空白對(duì)照的58.12%提高至67.02%，且比1mmol·L-1的Mg2+、Mn2+或Ca2+更有效地促進(jìn)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌H1對(duì)氨氮的去除。王秀蘅等[9]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+質(zhì)量濃度為5～20mg·L-1時(shí)促進(jìn)了活性污泥中化能自養(yǎng)型硝化細(xì)菌對(duì)廢水中氨氮的硝化與去除。以上報(bào)道證實(shí)了Fe2+促進(jìn)細(xì)菌自養(yǎng)硝化、異養(yǎng)硝化的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+也具有促進(jìn)YT03 菌好氧反硝化的作用。原因可能是Fe2+能夠提高細(xì)菌在硝化和反硝化過(guò)程中相關(guān)酶的活性，促進(jìn)氧化還原過(guò)程中電子的傳遞，加快細(xì)菌的增殖與代謝過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)氨氮、亞硝酸鹽氮的有效去除[9,18]。Mg2+、Mn2+和Ca2+分別可作為生物酶的輔助因子和用來(lái)維持細(xì)菌的運(yùn)輸系統(tǒng)與滲透平衡[8]，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，這三種金屬離子對(duì)YT03 菌的生長(zhǎng)和降解亞硝酸鹽雖然有一定的促進(jìn)作用，但不如Fe2+明顯。Ca2+雖然能提高YT03 對(duì)亞硝酸鹽的降解率，但這種促進(jìn)作用不顯著，因此在YT03 降解亞硝酸鹽的過(guò)程中不必添加Ca2+。

對(duì)照組Mo6+的添加濃度為0mg·L-1時(shí)，YT03 菌對(duì)亞硝酸鹽的去除率相對(duì)于不含氨氮時(shí)明顯降低。該現(xiàn)象可能是YT03 在氨氮和亞硝酸鹽氮同時(shí)存在的情況下，也可利用氨氮作氮源進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)，進(jìn)而對(duì)亞硝酸鹽氮的利用和去除速率減慢[14]，導(dǎo)致實(shí)際測(cè)得的亞硝酸鹽降解率下降。而與對(duì)照組相比，增加Mo6+的添加濃度對(duì)亞硝酸鹽去除率沒(méi)有明顯的促進(jìn)或抑制作用。酶促反應(yīng)[19]顯示，在泛養(yǎng)副球菌Paracoccus pantotrophus P16 的培養(yǎng)基中添加2.4μmol·L-1Mo6+（相當(dāng)于0.23mg·L-1Mo6+）可提高膜結(jié)合硝酸鹽還原酶的活性（1.39 倍），而對(duì)亞硝酸鹽還原酶活性未表現(xiàn)出促進(jìn)作用。因此，Mo6+可能與亞硝酸鹽反硝化過(guò)程的亞硝酸鹽還原酶無(wú)關(guān)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Cu2+抑制異養(yǎng)硝化-好氧反硝化氣單胞菌Aeromonas sp.HN-02 的作用，1mg·L-1Cu2+可使HN-02 菌對(duì)氨氮去除率由對(duì)照組的將近100%降至17.22%[20]；Zn2+大于30mg·L-1時(shí)，好氧硝化細(xì)菌對(duì)總氮的去除率由對(duì)照組的近70%降低至36.23%[11]；添加0.1 mmol·L-1Cu2+（相當(dāng)于6.36mg·L-1Cu2+）或Co2+（相當(dāng)于5.89mg·L-1Co2+）導(dǎo)致好氧反硝化菌-地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis JH8 幾乎不生長(zhǎng)，且無(wú)反硝化作用[13]。在模擬廢水中添加1mmol·L-1Cu2+（相當(dāng)于63.55mg·L-1Cu2+）可以提高異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌H1 在異養(yǎng)硝化過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性，促進(jìn)硝化作用[18]；Cu2+濃度小于或等于0.5mg·L-1時(shí)能促進(jìn)好氧反硝化作用，總氮去除率從Cu2+濃度為0mg·L-1時(shí)的67.93%增加到0.5 mg·L-1時(shí)的79.26%，Cu2+濃度大于0.5mg·L-1時(shí)則抑制好氧反硝化作用，Cu2+濃度為100 mg·L-1時(shí)總氮去除率下降到4.41%[11]。綜上所棕，Zn2+、Cu2+等可能對(duì)一些好氧菌的硝化或反硝化具有促進(jìn)作用，而對(duì)另一些好氧菌的活性沒(méi)有促進(jìn)作用，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用。金屬離子對(duì)好氧反硝化細(xì)菌的影響也與添加量有關(guān)，適量金屬離子可能會(huì)提高酶的活性，促進(jìn)細(xì)菌的硝化反硝化過(guò)程，過(guò)量則反而會(huì)產(chǎn)生抑制作用，對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒害作用。因此要注意控制養(yǎng)殖污水中Zn2+、Cu2+和Co2+等金屬離子的含量，避免抑制細(xì)菌活性甚至引起細(xì)菌中毒或死亡[6,11,20]。

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了多種金屬離子對(duì)嗜油不動(dòng)桿菌YT03 生長(zhǎng)和降解亞硝酸鹽的影響。Fe2+在優(yōu)選濃度0.50mg·L-1下可使YT03 菌對(duì)亞硝酸鹽的去除率提高至未添加Fe2+時(shí)的4.93 倍。Mg2+或Mn2+的優(yōu)選添加濃度分別為18.48 mg·L-1或0.65 mg·L-1，此時(shí)YT03 菌對(duì)亞硝酸鹽的去除率分別是不添加相應(yīng)金屬離子時(shí)的1.25 和1.16 倍，有顯著促進(jìn)作用。Ca2+和Mo6+對(duì)YT03 菌好氧反硝化降解亞硝酸鹽沒(méi)有顯著影響。添加0.51 mg·L-1、0.06 mg·L-1或0.05 mg·L-1Zn2+、Cu2+或Co2+明顯抑制YT03 菌降解亞硝酸鹽。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)e、Mg 和Mn 對(duì)嗜油不動(dòng)桿菌YT03 好氧反硝化去除亞硝酸鹽具有顯著的促進(jìn)效果，而Zn、Cu 或Co 的存在則抑制YT03菌的反硝化效果，因此，利用嗜油不動(dòng)桿菌YT03 處理亞硝酸鹽污染的養(yǎng)殖水體時(shí)，應(yīng)適量添加Fe、Mg和Mn 等以促進(jìn)亞硝酸鹽的脫除，控制污染水體中Zn、Cu 及Co 等的含量，避免細(xì)菌去除亞硝酸鹽的效果下降。