電針干預佐劑性關節炎大鼠踝關節滑膜細胞凋亡的 MMP-3、MMP-9分子調節機制

朱俊,陳雨舟,陳云飛,李連波,周殷,蘇程果,周海燕,趙陽

(1.成都中醫藥大學針灸推拿學院/第三附屬醫院,成都 610075;2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院,上海 200437)

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis, RA)是以外周關節滑膜炎癥為特征的免疫性疾病,在我國的發病人數約有400多萬人[1-2]。關節滑膜炎癥產生的炎癥細胞因子誘導滑膜細胞過度增殖,并產生血管翳侵蝕軟骨表面,造成骨和軟骨的破壞,導致 RA患者病情進一步惡化。基質金屬蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3, MMP-3)和基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9, MMP-9)屬于基質金屬蛋白酶超家族,促進滑膜細胞異常增殖,在 RA病情進展中起著關鍵作用[3-5]。

課題組研究證實,電針配合常規藥物治療RA患者有較好的臨床療效;電針干預可以顯著控制關節炎大鼠模型的病情進展,減輕炎癥的程度[6-7]。本次研究是在既往研究的基礎上,以佐劑性關節炎大鼠(Adjuvant arthritis, AA)模型為研究對象,觀察電針干預對關節炎大鼠的關節炎癥和滑膜細胞凋亡的影響情況,以及滑膜局部 MMP-3、MMP-9的 mRNA和蛋白表達水平,深入探討電針干預RA關節炎癥的分子機制,為臨床上電針治療RA提供新的實驗證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及倫理

SPF級雄性SD大鼠32只(成都達碩動物有限責任公司提供),6周齡,飼養于成都中醫藥大學針灸推拿學院/第三附屬醫院實驗中心動物房。適應性飼養 1周,大鼠可以自由飲水、飲食、活動。標準光照周期(12 h光照/12 h黑暗),室內溫度為(24±2)℃,濕度(65±10)%。

本實驗研究通過成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(倫理編號2018-05),動物實驗根據3Rs原則以及NIH動物護理和指南進行。

1.1.2 試劑

弗氏完全佐劑(批號F-5881),美國Sigma公司;一抗(MMP-3,批號ab52915;MMP-9,批號ab38898),Abcam公司;Tunnel試劑盒(批號11684817910),Roche公司。

1.1.3 設備

電針治療儀(蘇州醫療用品廠,型號 SDZ-Ⅱ),超聲細胞粉碎機(寧波新芝生物,型號 JY92-Ⅱn),臺式高速冷凍離心機(Heal Force,型號 Neofuge 15R),全自動研磨儀(賽維爾生物,型號 KH-Ⅲ),熒光定量 PCR擴增儀(美國 Bio-Rad,型號 CFX96),Trans-Blot?Turbo? Transfer System(美國 Bio-Rad),光學顯微鏡(日本Olympus公司,型號BX51)。

1.2 分組及造模

32只SD大鼠被隨機分為生理鹽水組、模型組、電針干預組和假電針干預組,每組 8只。參考 Zhu J等[7],生理鹽水組大鼠用0.1 mL生理鹽水模擬造模,其余各組大鼠的雙側足墊內分別用0.1 mL弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant CFA)注射進行造模。

關節炎模型的評價[8],分為0～4分,0分為大鼠踝關節無腫脹,無顏色改變;1分為大鼠踝關節皮膚鮮紅色且輕度腫脹;2分為大鼠踝關節出現明顯的紅腫,但未出現足趾變形;3分為大鼠踝關節至足趾部位嚴重紅腫,足趾無跖曲;4分為大鼠踝關節至足趾部位嚴重紅腫,足趾跖曲,且不能負重。評分≥3分即為造模成功。

1.3 電針治療方式

參考Zhu J等[7]文獻,造模后3 d開始,電針干預組大鼠固定后,取雙側足三里穴(ST36,后肢膝關節后外側,腓骨小頭下約5 mm處)和懸鐘穴(GB39,后肢外踝尖上10 mm處),局部消毒處理,用0.25 mm×25 mm毫針針刺,足三里穴針刺深度為7 mm,懸鐘穴約3 mm;接電針儀正、負電極,刺激參數為電壓3 V,連續波,頻率2 Hz,15 min,針刺強度以針身微微跳動而大鼠處于安靜狀態為宜。每2天1次,共計8次。

假電針干預組大鼠在足三里、懸鐘穴旁5 mm處予以0.25 mm×25 mm毫針輕輕透皮但不刺入肌肉內,刺激強度與電針干預組相同。生理鹽水組和模型組大鼠予以自制大鼠固定器固定,不予其他干預。

1.4 觀察指標和方法

1.4.1 標本收集

在實驗第18天,所有大鼠禁食24 h后被麻醉脫臼處死,取左側踝關節做HE染色觀察和Tunnel觀察,右側踝關節滑膜組織做RT-PCR和Western blot檢測。

1.4.2 踝關節病理形態學

踝關節滑膜組織予以脫鈣、脫水,石蠟包埋,4 μm連續切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色,封片,光鏡下(×200)觀察踝關節的病理形態學改變。

1.4.3 滑膜細胞凋亡觀察

滑膜細胞凋亡采用Tunnel法進行檢測,4 μm石蠟切片脫蠟至水,修復,破膜,取Tunnel試劑盒內適量試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按1:9混合,加到對應組織,DAPI復染細胞核,抗熒光淬滅封片劑封片,切片于(×200)熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為藍色,陽性凋亡細胞核為綠色。

1.4.4 滑膜MMP-3、MMP-9基因表達

采用RT-PCR檢測滑膜MMP-3、MMP-9的mRNA表達水平。踝關節滑膜組織制備勻漿,加入200 μL氯仿提取總RNA,RNA沉淀后,加入適量DEPC處理水完全溶解后得到總RNA,采用核酸定量儀對RNA的純度及降解情況進行測定。根據反轉錄反應體系進行反轉錄,后進行熒光定量PCR反應體系測定RNA表達情況。反應條件為預變性溫度 95℃,時間 2 min,循環 1次;變性溫度95℃,時間10 s;退火溫度Tm,30 s,循環40次,延伸溫度95℃,時間10 s;60℃,1 min,95℃,15 s。檢測結果取三孔的平均值。基因序列見表1。

1.4.5 滑膜MMP-3、MMP-9蛋白表達

采用Western Blot檢測滑膜MMP-3、MMP-9蛋白表達水平。滑膜組織樣品制備,BCA蛋白定量檢測,10 μL移液器上樣,90 V恒壓凝膠電泳;取出PVDF膜,與一抗(MMP-3,1:200;MMP-9,1:200)雜交,ECL顯影,膠片掃描,Image J軟件分析其灰度值。

表1 MMP-3、MMP-9、GAPDH基因序列

1.5 統計學方法

采用SPSS15.0統計軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示,方差齊性者采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠踝關節病理形態情況

如圖1所示,生理鹽水組大鼠踝關節滑膜組織細胞呈單層排列,無炎性細胞浸潤和滑膜細胞增生。模型組和假電針干預組大鼠踝關節滑膜細胞呈過度增殖狀態,炎性細胞顯著增多。電針干預組大鼠踝關節滑膜組織中滑膜細胞增生程度顯著低于模型組和假電針干預組,且炎性細胞數較少。

2.2 大鼠踝關節滑膜細胞凋亡情況

如圖2所示,綠色顯影即代表凋亡細胞數量,藍色顯影代表正常細胞數量。生理鹽水組大鼠踝關節滑膜細胞僅存在少量的陽性凋亡細胞,模型組大鼠踝關節滑膜陽性凋亡細胞數量顯著多于生理鹽水組,假電針干預組的陽性細胞數量與模型組相比無明顯差異,電針干預組大鼠的陽性細胞大量表達,高于其余各組。

圖1 各組大鼠踝關節滑膜組織病理形態情況(光學顯微鏡,×200)

2.3 各組大鼠踝關節滑膜組織 MMP-3、MMP-9 mRNA表達

統計結果顯示,MMP-3、MMP-9 mRNA表達在不同組別之間存在顯著性差異(P=0.001,P=0.001)。如圖 3A所示,MMP-3在模型組中的表達為43.78±23.61,顯著高于其在生理鹽水組的表達 1.70±0.82(P=0.008);MMP-3在電針干預組中的表達為12.65±6.55,顯著低于其在模型組的表達情況(P=0.036);MMP-3在假電針干預組中的表達為 28.72±15.17,與模型組比較差異無統計學意義(P=0.586),MMP-3在電針干預組的表達顯著低于假電針干預組的表達水平(P=0.034)。

如圖3B所示MMP-9在模型組中的表達為120.76±55.73,顯著高于生理鹽水組的 1.64±1.01(P=0.003);MMP-9在電針干預組中的表達為 8.78±3.67,顯著低于其在模型組的表達水平(P=0.004);MMP-9在假電針干預組中的表達為 73.49±30.10,與模型組比較差異無統計學意義(P=0.283)。MMP-9在電針干預組的表達顯著低于假電針干預組的表達(P=0.002)。

2.4 各組大鼠踝關節滑膜組織MMP-3、MMP-9蛋白表達

統計結果顯示,MMP-3、MMP-9蛋白表達在不同組別之間存在顯著性差異(P=0.001,P=0.001)。如圖 4A所示,MMP-3在模型組中的表達為0.88±0.30,顯著高于其在生理鹽水組的表達 0.24±0.15(P=0.001);MMP-3在電針干預組中的表達為 0.49±0.28,顯著低于其在模型組的表達水平(P=0.012);MMP-3在假電針干預組中的表達為 0.79±0.37,與模型組比較差異無統計學意義(P=0.549)。MMP-3在電針干預組中的表達顯著低于其在假電針干預組的表達水平(P=0.048)。

圖2 各組大鼠踝關節滑膜細胞凋亡情況(熒光顯微鏡,×200)

圖3 各組大鼠踝關節滑膜組織MMP-3、MMP-9 mRNA表達(,n=8)

如圖4B所示,MMP-9在模型組中的表達為0.93±0.29,顯著高于其在生理鹽水組的表達 0.27±0.19(P=0.001);MMP-9在電針干預組中的表達為 0.48±0.17,顯著低于其在模型組的表達水平(P=0.001);MMP-9在假電針干預組中的表達為 0.83±0.34,與模型組比較差異無統計學意義(P=0.449)。MMP-9在電針干預組中的表達顯著低于其在假電針干預組的表達水平(P=0.010)。Western blot檢測各組大鼠 MMP-3、MMP-9的表達情況見圖5。

圖4 各組大鼠踝關節滑膜組織MMP-3、MMP-9蛋白表達(,n=8)

圖5 Western BIot檢測各組大鼠MMP-3、MMP-9的表達情況

3 討論

類風濕關節炎屬于中醫學“痹證”范疇,其病機多為本虛標實。臨床研究證實,電針治療可以顯著抑制RA患者的關節疼痛、腫脹等情況,改善患者的生活質量,控制病情進展[9-10]。電針能有效降低RA患者外周血和關節滑液中炎性細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF的表達水平,提高抑炎性細胞因子IL-4、IL-10的表達水平,改善RA患者的免疫平衡狀態[11-12]。

動物實驗也證實電針干預可以顯著抑制關節炎大鼠模型的炎癥進展[13]。電針能夠上調RA大鼠下丘腦和脊髓腺苷 A1受體的表達,實現其鎮痛效應;電針可能上調滑膜β-END和 MOR、KOR、DOR表達水平,實現對RA大鼠的疼痛干預效應[14-16]。在系統免疫方面,電針足三里、懸鐘穴可以顯著改善RA動物模型的系統性炎癥,降低CD4+IL-17+Th17細胞在脾臟中的表達數量,增加Foxp3+Treg細胞的表達數量,改善機體內的免疫平衡狀態,減輕外周炎性細胞因子的表達水平[13]。在關節炎癥局部,電針足三里、懸鐘穴可以顯著抑制滑膜局部炎癥細胞浸潤[17]。這些研究從干預系統性炎癥、局部炎癥和鎮痛角度進行闡釋,而對異常增殖的滑膜細胞本身的關注較少。本次研究是在此基礎之上,進一步探討電針干預對關節炎異常增殖的滑膜細胞的影響情況。

異常增殖的滑膜細胞是 RA關節炎癥和血管翳形成的核心環節[18]。低氧導致滑膜細胞處于缺氧狀態,進而導致滑膜組織內出現異常的新生血管,將炎性細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α等帶入滑膜組織內,導致滑膜細胞出現炎性反應而過度增殖,導致RA病情進一步加重。因而促進異常增殖的滑膜細胞凋亡是控制 RA病情進展的關鍵所在。筆者前期研究證實電針可以抑制關節炎大鼠的滑膜新生血管的標志物CD34的表達,減少新生血管形成,減輕關節炎癥的發生[7]。Tunnel顯示電針干預組的免疫熒光數高于模型組和假電針干預組,HE染色顯示,電針干預組大鼠的關節炎癥顯著輕于模型組。提示電針可以顯著促進增殖的滑膜細胞凋亡,進而抑制了模型大鼠的關節炎癥發生,這與我們的前期研究結果相吻合。

MMP-3和MMP-9在RA發病過程中起著關鍵的作用,可以促進滑膜細胞的異常增殖和軟骨的破壞[19]。MMP-3和MMP-9在RA患者外周血中均被檢測出高表達水平,且與RA病情的嚴重程度呈正相關性,甚至導致關節軟骨出現破壞[20]。MMP-3和MMP-9的表達與滑膜細胞增殖呈現出密切的相關性,控制MMP-3和MMP-9在滑膜局部的表達可以有效地促進滑膜細胞的凋亡[21-23]。本次實驗研究證實,電針干預可以顯著地降低 MMP-3和MMP-9的基因和蛋白表達水平。在其他類型的疾病動物模型中,電針干預對MMP-3和MMP-9的表達也顯示出類似的趨勢[24-26]。這些研究情況與本實驗研究結果一致。

假電針干預是目前針刺研究中的熱點問題。臨床研究顯示,電針經穴相對于在非經非穴處進行電針干預,可以更加有效地改善RA患者的生活質量[9];而相同方式的臨床研究顯示,電針可以更有效地改善老年便秘患者的癥狀[27]。在動物實驗中,相比于非經穴處電針干預,電針特定穴位預處理能更加有效地提高敗血癥模型小鼠的存活率[28]。本研究選用在大鼠足三里、懸鐘穴旁開進行經皮電刺激,結果與前期的文獻報道一致,電針干預對AA大鼠MMP-3和MMP-9的抑制作用顯著優于假電針干預組。顯示出電針干預的有效性。

綜上所述,電針干預可以顯著促進AA大鼠的滑膜細胞凋亡,其作用機制可能通過降低 MMP-3和 MMP-9的表達實現。然而本次研究沒有用阻斷劑阻斷來驗證電針的干預效應,對細胞凋亡的數量未進行半定量分析,這些是本次實驗不足的地方。在進一步的研究中,筆者將繼續圍繞滑膜細胞凋亡的相關分子機制進行分析,為電針臨床治療RA提供更加有力可靠的實驗依據。