芒針對脊髓損傷大鼠運動功能和炎癥水平的影響

呂建蘭,胡勁濤,柴樂,錢劍勝,任偉凡,全仁夫

(1.浙江中醫藥大學,杭州 310053;2.浙江中醫藥大學附屬江南醫院,蕭山 311200)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)作為脊柱損傷后最嚴重的并發癥之一,每年發病率約為20～40例/100萬人[1],其致殘率高、治愈率低,給患者身心帶來嚴重創傷。脊髓在遭受直接外力后,會出現不可逆的原發性損傷,在原發性損傷的幾秒鐘內,機體會啟動一系列繼發性級聯反應,包括炎性反應、細胞凋亡、自由基損傷等,從原發性損傷部位擴散,造成脊髓的二次損傷,導致患者運動、排尿功能喪失[2]。前期研究發現,芒針秩邊和水道穴可以減少神經細胞凋亡,改善大鼠排尿功能[3-4]。本實驗通過芒針深刺秩邊穴,觀察芒針干預后大鼠運動功能變化和炎癥因子含量的變化,探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級成年雄性 Wister大鼠 81只,體質量(230±20)g,購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司[動物使用許可證號為 SCXK(滬)2017-0005],由浙江中醫藥大學實驗動物中心分籠飼養,每籠4只,溫度20～24℃,濕度50%～70%,適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素-伊紅(上海依赫生物科技有限公司)、乙醇(杭州化學試劑有限公司)、二甲苯(廣州市振發貿易有限公司)、鹽酸(濟南坤豐化工有限公司)、氨水(杭州長征化工廠)、多聚甲醛(天津市化學試劑研究所)、酶聯免疫檢測試劑盒(R&D,美國)、TaKaRa試劑盒(Invitrogen公司,美國)、Trizol試劑(Invitrogen公司,美國);0.30 mm×50 mm針灸針(江蘇佳辰牌),10 g克氏針(江蘇金鹿醫療器械公司,ZX105),恒溫箱(上海森信實驗儀器有限公司),勻漿器(金偉實驗儀器,江蘇),Bio-Tek ELX800全自動酶標儀(Thermo Scientific Varioskan Flash),AP280-2包埋機(MICROM公司),HM335E切片機(MICROM公司),Nikon eclipse 80i顯微鏡(Nikon公司),Step one plus PCR儀(美國ABl)。

1.3 脊髓損傷模型的建立

應用改良 Allen's造模法[5]制備大鼠脊髓損傷模型,實驗順序隨機進行。大鼠稱重后用 3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)[6]腹腔注射麻醉,待大鼠無四肢反應后將其俯臥位于操作臺上,以第11肋為標志找出T11棘突,沿背部正中由T11棘突向頭部方向作一長約2.5 cm的切口,鈍性分離椎旁肌肉,咬除 T9-10棘突及全部椎管,暴露 0.5 cm寬硬膜,用自制的改良打擊裝置(質量為10 g的克氏針沿帶有刻度的透明管從60 mm高處垂直自由下落,致傷量為60 g/cm)造成脊髓中度損傷,使大鼠出現痙攣性擺動、擺尾反射,致傷后迅速移開打擊物,逐層縫合切口,大鼠出現雙下肢遲緩性癱瘓,BBB評分小于2分,證明造模成功[7-8]。造模后每日2次人工膀胱按摩協助排尿。

1.4 大鼠分組及處理

選擇健康雄性Wister大鼠81只,隨機分為正常組9只、模型組36只和芒針組36只,分別于術后1 d、3 d、5 d、7 d行BBB評分,術后1 d、3 d、5 d、7 d取受損段脊髓行ELISA檢測、RT-qPCR檢測和HE染色。模型組大鼠正常飼養不作其他處理,芒針組大鼠于術后麻醉蘇醒后開始行雙側秩邊穴芒針治療,每日1次,每次30 min,治療前需人工按摩排空膀胱。

1.5 實驗干預

參照《實驗針灸學》[9]取穴標準確定大鼠秩邊穴,在臀外下部,股骨大轉子與薦椎尾椎結合部連線外1/3與中1/3交點處(圖1[10])。針刺前人工按摩排空膀胱,用長50 mm針灸針在大鼠秩邊穴直刺,輕捻緩進達同側腹部皮下,深度2 cm左右(圖2),每5 min捻轉行針1次,30 min后出針。

圖1 大鼠秩邊穴示意圖

圖2 大鼠針刺圖

1.6 行為學觀察及運動功能評價

參照Basso DM等[11]BBB運動功能評分法,分別于術后1 d、3 d、5 d、7 d對大鼠后肢運動功能進行評價,評分范圍為0～21分。采用雙人雙盲獨立觀察,觀察者為非本組實驗人員,但對評分標準熟悉。因大鼠晝夜活動差別較大,評分均于晚上 7點進行,觀察期為2 min,每只測3次,取其平均值,最后結果為兩位觀察者的平均記錄分數。評價前檢查所有動物膀胱是否充盈,以免因膀胱充盈而影響活動。

1.7 脊髓組織取材

將正常組大鼠及1 d、3 d、5 d、7 d的模型組和芒針組大鼠隨機取6只,腹腔注射過量戊巴比妥鈉,待動物麻醉后于冰上迅速剪取長約1 cm受損段脊髓組織存入-80℃冰箱,用于ELISA檢測和RT-qPCR檢測;每組另取3只大鼠,戊巴比妥鈉深度麻醉,生理鹽水心臟灌注后迅速取損傷段脊髓,4%多聚甲醛固定,乙醇梯度脫水,透明后浸臘包埋,連續切片,片厚4 μm,用于蘇木素-伊紅染色。

1.8 指標檢測

1.8.1 ELISA檢測

按照大鼠 HMGB1、NF-κB、IL-6酶聯免疫檢測試劑盒使用說明書進行操作,采用生物素雙抗夾心技術檢測脊髓組織中 HMGB1、NF-κB、IL-6水平。簡要實驗步驟為準備試劑(生物素標記的抗 HMGB1抗體、抗NF-κB抗體、抗IL-6抗體、鏈霉親和素-HRP),將標準品梯度稀釋;加入準備好的樣品、標準品、生物素標記二抗和酶標試劑,37℃反應1 h;洗板5次,加入顯色液A、B,37℃避光顯色 10 min;加入終止液終止反應;10 min內讀取各孔的吸光度(OD值)。根據標準液的檢測結果得出標準曲線,求出各組樣品的實際濃度。

1.8.2 HE染色

將切片置60℃烤箱烘烤2 h,二甲苯、乙醇梯度脫水后蘇木素初染5 min,流水沖洗2 min,0.5%鹽酸乙醇分化5 s,流水沖洗1 min,0.5%稀氨水返藍20 s,流水沖洗3 min,0.5%伊紅染液染色2 min,流水沖洗1 min,80%和 95%乙醇依次脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,Nikon DS-Fi1 500萬象素 CCD相機(Nikon,Tokyo,apan)攝片。

1.8.3 RT-qPCR檢測

采用Trizol法分組提取總RNA,檢測RNA濃度及純度。按照TaKaRa試劑盒說明書進行反轉錄反應,以待檢測基因的引物為模板(引物序列見表1),采用Step one plus PCR儀(美國 ABl)進行熒光定量 PCR檢測,以β-actin作為內參進行相對定量分析。

表1 引物序列

1.9 統計學方法

應用SPSS20.0統計軟件分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示,采用重復測量方差分析檢驗主效應、時間效應和交互效應,組間差異采用單因素方差分析,兩兩比較應用LSD法(方差齊)或Tunnett T3法(方差不齊)。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學觀察和BBB評分

脊髓損傷后,模型組和芒針組大鼠的 BBB評分明顯低于正常組,差異有統計學意義(P＜0.01);芒針治療后,芒針組大鼠的BBB評分高于模型組,在5 d和7 d時差異有統計學意義(P＜0.01),說明芒針的治療效果與治療療程之間存在時間效應(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠BBB運動功能評分比較 (,分)

表2 各組大鼠BBB運動功能評分比較 (,分)

注:與正常組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

模型組 9 1.00±0.661) 1.80±0.911) 2.20±0.631) 3.20±0.631)芒針組 9 1.30±0.671) 2.40±0.841) 4.60±0.961)2) 7.40±1.071)2)正常組 9 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00

2.2 脊髓組織中HMGB1、NF-κB及IL-6水平比較

為了測試芒針治療是否可抑制 HMGB1、NF-κB、IL-6等相關炎性因子的表達,分析了損傷節段脊髓組織中HMGB1、NF-κB、IL-6水平及HMGB1mRNA、NF-κBmRNA、IL-6mRNA水平。脊髓損傷后,模型組和芒針組大鼠脊髓組織中 HMGB1、NF-κB、IL-6水平及 HMGB1mRNA、NF-κBmRNA、IL-6mRNA水平較正常組升高,差異有統計學意義(P＜0.05);芒針治療后,芒針組大鼠脊髓組織中HMGB1、NF-κB、IL-6水平及HMGB1mRNA、NF-κBmRNA、IL-6mRNA水平較模型組下降,在3 d、5 d和7 d時差異有統計學意義(P＜0.05),說明芒針治療對炎癥因子的表達具有明顯的抑制作用。詳見表3-8。

表3 各組大鼠脊髓組織中HMGB1水平比較 (,ng/mL)

表3 各組大鼠脊髓組織中HMGB1水平比較 (,ng/mL)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

模型組 6 1.902±0.1161) 1.940±0.0981) 1.933±0.1021) 1.931±0.0971)芒針組 6 1.796±0.0681) 1.706±0.0581)2) 1.637±0.0681)2) 1.591±0.0551)2)正常組 6 1.316±0.011 1.316±0.011 1.316±0.011 1.316±0.011

表4 各組大鼠脊髓組織中NF-κB水平比較 (,pg/mL)

表4 各組大鼠脊髓組織中NF-κB水平比較 (,pg/mL)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 術后1 d 術后3 d 術后5 d 術后7 d模型組 6 2229.16±141.281) 2295.42±98.361) 2244.07±107.111) 2223.36±200.441)芒針組 6 2056.73±157.741) 1770.72±100.281)2) 1639.63±131.401)2) 1564.06±173.121)2)正常組 6 1346.10±131.50 1346.10±131.50 1346.10±131.50 1346.10±131.50

表5 各組大鼠脊髓組織中IL-6水平比較 (,pg/mL)

表5 各組大鼠脊髓組織中IL-6水平比較 (,pg/mL)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

模型組 6 289.89±18.391) 303.55±20.591) 292.21±16.021) 282.94±24.151)芒針組 6 281.05±15.091) 244.24±17.531)2) 193.66±18.361)2) 179.29±22.441)2)正常組 6 109.87±9.37 109.87±9.37 109.87±9.37 109.87±9.37

表6 各組大鼠脊髓組織中HMGB1mRNA水平比較 ()

表6 各組大鼠脊髓組織中HMGB1mRNA水平比較 ()

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 術后1 d 術后3 d 術后5 d 術后7 d模型組 6 0.000907±0.0000331) 0.001263±0.0000601) 0.001123±0.0000401) 0.000992±0.0000441)芒針組 6 0.000911±0.0000321) 0.000885±0.0000211)2) 0.000858±0.0000211)2) 0.000799±0.0000281)2)正常組 6 0.000627±0.000028 0.000627±0.000028 0.000627±0.000028 0.000627±0.000028

表7 各組大鼠脊髓組織中NF-κBmRNA水平比較 ()

表7 各組大鼠脊髓組織中NF-κBmRNA水平比較 ()

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 術后1 d 術后3 d 術后5 d 術后7 d模型組 6 0.001498±0.0000301) 0.001663±0.0000441) 0.001593±0.0000471) 0.001500±0.0000381)芒針組 6 0.001275±0.0000361) 0.001208±0.0000301)2) 0.001130±0.0000441)2) 0.000992±0.0000311)2)正常組 6 0.000759±0.000026 0.000759±0.000026 0.000759±0.000026 0.000759±0.000026

表8 各組大鼠脊髓組織中IL-6mRNA水平比較 ()

表8 各組大鼠脊髓組織中IL-6mRNA水平比較 ()

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 術后1 d 術后3 d 術后5 d 術后7 d模型組 6 0.001697±0.0000611) 0.001799±0.0000421) 0.001680±0.0000791) 0.001486±0.0000271)芒針組 6 0.001541±0.0000381) 0.001453±0.0000521)2) 0.001370±0.0000391)2) 0.001323±0.0000411)2)正常組 6 0.000934±0.000059 0.000934±0.000059 0.000934±0.000059 0.000934±0.000059

2.3 脊髓組織的HE染色

正常組脊髓灰質和白質結構正常,神經細胞呈正常的組織結構,神經元細胞類圓形,胞漿豐富,邊界清晰,周圍有較多的中小型神經細胞及膠質細胞;模型組脊髓組織松散,灰質中有許多空洞形成,伴有炎性細胞浸潤,神經元細胞固縮;芒針組在損傷初期,脊髓構造欠清晰,損傷部位的空洞明顯,殘留的神經元結構不清,隨著治療周期延長,損傷部位的空洞及炎性細胞逐漸減少,神經元細胞形態好轉。詳見圖3。

3 討論

眾所周知,炎癥反應是脊髓損傷后繼發性損害的主要機制之一。脊髓損傷后的炎癥浸潤,會擴大脊髓壞死和凋亡的實際部位,加劇脊髓組織變性,抑制脊髓功能恢復[12]。大量臨床研究發現,許多疾病的發生、發展均與HMGB1參與的炎癥反應相關[13-14]。HMGB1作為一種重要的促炎介質,其表達的增加可能直接導致下游炎癥因子表達的上調[15];IL-6主要是由T細胞和巨噬細胞分泌,刺激免疫反應,是引起炎癥反應的重要促炎因子[16-17],當它與HMGB1結合后可增強炎癥反應的活性;NF-κB是介導炎癥反應重要的轉錄因子,其參與調節許多炎癥的基因和信號通路[18],而其介導的信號通路可調控相關促炎因子的表達[15]。通過實驗證明了脊髓損傷后 HMGB1、NF-κB和 IL-6呈高表達,芒針治療一段時間后,HMGB1、NF-κB和IL-6表達明顯降低,而未予任何治療的模型組,HMGB1、NF-κB和IL-6仍處于高表達狀態。從而推測,芒針的抗炎機制可能包括抑制HMGB1的表達,降低NF-κB信號通路的傳導,下調促炎因子IL-6的分泌。

針灸作為中醫學的瑰寶,具有抗炎、抗凋亡、鎮痛等作用[19],芒針作為一種特制的長針,因形狀細長如麥芒,故稱芒針。《靈樞·九針論》記載:“八曰長針,取法于綦針,長七寸,主取深邪遠痹者也。”芒針的針刺特點是深刺透穴,其取穴精簡,針感強,通過穴位、經絡和神經體液起到加強表里經、鄰近經的經氣流通,特別適合癱瘓、軟組織疼痛等疾病的治療[20]。本研究結果顯示,芒針治療后大鼠的BBB評分比未治療大鼠高,隨著治療周期的延長,兩組評分差異加大,說明芒針治療對脊髓損傷后大鼠運動功能的恢復有促進作用。

根據中醫學氣血經絡理論,脊髓所過之處可受督脈、膀胱經及華佗夾脊的經氣濡養,許多研究選用損傷段局部的夾脊穴針刺,直達病所,促進損傷后神經功能的重建[21-22]。因本實驗脊髓損傷模型大鼠椎板被咬除,針刺夾脊穴或者督脈穴位,易刺傷脊髓,故未采用損傷局部的夾脊穴作研究。而且,課題組大量研究發現秩邊穴透刺,也可促進神經功能的恢復[23]。秩邊穴[24]屬足太陽膀胱經穴,位于第21椎下旁開3寸,與骶管裂孔相平,深層正對坐骨大孔,有臀下血管、臀下神經、股后皮神經、陰部神經及坐骨神經通過,是芒針重用穴之一,對秩邊穴行不同方向和深度的針刺,伴隨針感傳導部位的不同,所治之癥也各異,既可治療小便不利,又可治療下肢痿痹[25],《中華特針臨床發揮》一書中就有秩邊穴直刺治療下肢痿證的記載。筆者通過臨床實踐發現,當秩邊穴深刺至坐骨大切跡后上方髂翼外面的骨面,酸脹感可向同側下肢放射至小腿或足踝部,產生與透刺相當的針感,這樣也可避免透刺過程中因操作人員解剖不熟練而造成局部的神經損傷。本實驗采用大鼠秩邊穴深刺,針尖直抵同側腹部皮下,進針深度 2 cm左右,手下有沉緊感為得氣。

據《黃帝內經》記載,脊髓損傷應按“體墮”和“痿證”進行辨證論治,“體墮”指的是急性脊髓損傷,而“痿證”多指慢性脊髓損傷或急性脊髓損傷后期。中醫學在治療“痿證”上療效確切,臨床報道并不少見,但關于“體墮”治療的報道卻不多,曾有人提出在急性脊髓損傷術后立即配合針灸、中藥治療,可有效降低脊髓損傷的并發癥,而且,針灸干預越早,患者神經功能恢復的情況越好[26]。本研究通過人為條件造成大鼠急性脊髓損傷模型,通過檢測發現損傷段脊髓組織中的HMGB1、NF-κB及IL-6大量聚集,HMGB1作為一種重要的促炎癥反應的DNA結合蛋白[27-28],可能是脊髓損傷后炎癥信號的觸發器[29],可導致促炎因子 IL-6的釋放,當IL-6與HMGB1結合后又可增強炎癥反應的活性;同時,脊髓損傷后NF-κB的大量表達,也可調控促炎因子IL-6的表達。所以,三者之間相互作用,介導了脊髓損傷后的炎癥級聯反應[30]。因此推測,作為促炎介質的HMGB1可能協同相關炎癥因子參與脊髓損傷后的炎癥反應,加劇脊髓損傷,影響大鼠運動功能的恢復,但其具體調控通路尚不清楚,這也是本課題組下一步的研究方向。另外,觀察各時間點大鼠的BBB評分發現,同一時間點,芒針治療組大鼠的運動評分較模型組高,脊髓組織中的炎性因子表達較模型組明顯減少,表明芒針對脊髓損傷后的炎癥反應有一定抑制作用,其抗炎機制可能包括抑制HMGB1的表達,降低 NF-κB信號通路的傳導,下調促炎因子IL-6的分泌。芒針作為中醫學中一種特殊的療法,從治療的指導思想到選穴配方,都有其獨特之處,有望在神經系統、運動系統、精神系統等多學科中發揮其優勢。