利用網絡藥理學分析白術當歸七物湯治療結直腸癌的作用及機制

張士林，李敏，陳輝，孫文，項靈云,，馮覺平★

（1.湖北中醫藥大學，湖北 武漢；2.武漢市第四醫院（華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院）腫瘤科，湖北 武漢；3.江漢大學，湖北 武漢）

0 引言

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是胃腸道中最常見的惡性腫瘤之一，手術、放化療及分子靶向是其主要治療手段[1]。近年來研究表明，中醫藥對CRC 有較好的輔助治療效果[2]。

結直腸腫瘤歸屬于中醫的“腸覃”“腸風”“積聚”“腸積”“鎖肛痔”等，現代中醫認為CRC 的病因為癌毒發于內，瘀結于腸腑，與多種病邪互結，導致機體正氣失衡，無法抵御癌毒[3-4]。故通過辨證診治，采用化瘀散結、補益氣血等方法治療[5-6]。白術當歸湯由歸脾湯化裁而來，藥物組成為白術、當歸、茯苓、黃芪、木香、甘草、白藥蛇舌草。取其補益氣血，健脾養心之功效。但有關白術當歸湯治療CRC 機制的網絡藥理學研究尚未見報導，本研究基于網絡藥理學方法、白術當歸湯的化學成分、化學分子靶標、CRC 相關基因-蛋白相互作用等信息，構建“中藥化合物活性成分靶點蛋白互作網絡”“中藥化合物活性成分靶點-腸癌靶點蛋白互作網絡”，系統探討白術當歸湯治療腸癌的多成分、多靶點、多通路復雜機制，為后續研究提供信息。

1 資料和方法

1.1 白術當歸七物湯的活性成分及靶點篩選

本研究依托于中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以白術當歸七物湯的組成成分：白術、當歸、茯苓、黃芪、木香、甘草、蛇草；檢索本方所有化學成分，以生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥40%和類藥性（Druglikeness，DL）≥0. 2 作為活性化合物的篩選條件，提取相應的活性成分。應用TCMSP 數據庫平臺檢索白術當歸湯所有活性成分的靶基因。

1.2 大腸癌的疾病靶點篩選

GeneCard 數 據 庫（https：//www.genecards.org/）及OMIM 數據庫（https：//omim.org/）中，以“Colorectal cancer”為檢索詞，篩選得到CRC 的靶點，并應用Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/）對所篩選的靶點標準化。

1.3 活性成分與CRC 共同靶點篩選

應用R 語言（https）軟件3.6.2，通過編程將CRC 靶點與藥物靶點進行交集，并繪制韋恩圖。

1.4 Protein-protein interaction（PPI）網絡構建

CRC 與藥物共同靶點輸入在STRING（http：//string-db.org/cgi/input.pl）數據中，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，構建共同靶點互作用網絡PPI，評分條件設定為大于0.4，保證信息的置信度，隱藏孤立蛋白質，其他參數保持默認設置，獲得PPI 網絡。應用count.R 插件獲得共同蛋白靶點出現的頻次。

1.5 白術當歸七物湯藥物活性成分-CRC-靶點互作用網絡構建

利用Cytoscape 3.7.2 軟件中Merge 功能構建白術當歸七物湯藥物活性成分-CRC-靶點互作用網絡。網絡圖中“Node”代表活性成分和靶點，“Edge”代表活性成分-CRC-靶點之間的相互關系。

1.6 差異基因GO（Gene Ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因組百科全書）通路富集分析

利用R 語言（http）軟件對白術當歸七物湯藥物活性成分與CRC 的共同靶點進行GO 分析，GO 分析主要用于描述基因產物的功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能。并應用ClusterProfileKEGG.R 工具包進行KEGG Pathway 富集分析。

2 結果

2.1 白術當歸湯活性成分篩選

通過TCMSP 數據庫按照既定的篩選條件，去掉重復成分后獲得生物活性成分（83）個，表1。

2.2 CRC 的靶點篩選

通過檢索GeneCards、OMIM 數據庫得到CRC 的治療靶點，共得到8573 個CRC 的相關致病與治療基因。

2.3 活性成分與疾病共同靶點篩選

白術當歸七物湯的83 個活性成分相關治療靶基因經標準化后（不能標準化的予以刪除）與CRC8573 個疾病靶點交集共178個，得到Venny 圖（圖1）。

圖1 白術當歸七物湯活性成分靶基因與CRC 疾病基因交集Venn 圖

表1 白術當歸湯7 味中藥TCMSP 數據庫篩選的生物活性成分

續表1

圖2 白術當歸七物湯蛋白相互作用網絡圖

2.4 PPI 網絡構建

在STRING 數據平臺中，輸入178 個共同靶點名稱，按照既定的檢索條件構建蛋白互作網絡圖（圖2），利用COUNT.R 插件統計出現頻次前20 的蛋白靶點，出現頻次較高的AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、JUN、CASP3 蛋白靶點等，并繪制條形圖（圖3）。

圖3 白術當歸七物湯治療CRC 相關的高頻蛋白靶點

2.5 白術當歸七物湯活性成分-CRC-靶點互作用網絡構建

利用Cytoscape3.7.2 軟件在活性成分-CRC-靶點互作網絡圖中，共獲得255 個節點和1254 條邊（包括中間的疾病與藥物及關系）（圖4），其中紅色代表CRC，藍色代表藥物白術當歸七物湯，紫色代表白術當歸湯活性成分，黃色代表白術當歸湯與CRC 的共同靶點。

圖4 白術當歸湯的活性成分-CRC-靶點相互作用網絡圖

2.6 GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

利用R 軟件對178 個共同靶點進行GO 功能分析得到的柱狀圖（圖5）、氣泡圖（圖6）及KEGG 富集結果（圖7）。本結果中共有42 個信號通路富集靶點數目大于等于20。通過分析，共同靶點主要分布在Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection（卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染）、Hepatitis B（乙型肝炎）、Human cytomegalovirus infection（人 巨 細 胞 病 毒 感 染）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并發癥中AGE-RAGE 信號通路）、Fluid shear stress and atherosclerosis（脈沖剪切力與動脈粥樣硬化）等多條信號通路中。圖8 則基于卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路為例，顯示出白術當歸七物湯治療CRC 的靶點。

3 討論

中草藥在CRC 輔助治療中越來越被廣泛應用，它在改善癥狀、提高患者免疫能力等方面發揮了一定的作用。然而傳統的中草藥組方多為個體經驗，差異較大，因而常常無法客觀、有效地評估療效。組方之間的協同作用也無法提供更為科學的依據，其作用機制也無法系統研究，因而不被國際學術界廣泛認可與接受。

網絡藥理學是在“藥物成分-靶點-疾病”相互作用網絡的基礎上，觀察藥物與疾病內在關聯并分析多種藥物協同作用的一種方法[7]。利用網絡藥理學研究中藥復方的作用及其機制更為科學、系統，因而逐漸成為熱點。

圖5 GO 功能分析柱狀圖

圖6 GO 功能分析氣泡圖

圖7 KEGG 富集分析結果

圖8 白術當歸七物湯作用于Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection 信號通路（紅色表示可能靶點）

CRC 屬于中醫的“積聚”“腸積”等范疇，常常表現為血便、腹痛、便秘、腹瀉。歷代醫家對其治療見解各異，如漢唐主張通絡去瘀，宋金則以痰瘀論治，明清時期醫家則是以瘀為主，并主張瀉下攻積等多法靈活運用[8,9]。本方結合現代中醫思想，認為CRC 仍癌毒發于內，瘀結于臟胕，與多種病邪混合互結，致正氣消亡[3]，故以補益氣血，健脾養心的歸脾湯為基礎化裁而來。方中以黃芪、白術、甘草甘溫之品補脾益氣以生血，使氣旺而血生；當歸、茯苓補血養心安神；木香辛香而散，理氣醒脾；蛇草抑癌消瘀。組方具有一定的綜合性。本研究以網絡藥理學方法分析后獲得83 個活性成分，使得臨床白術當歸七物湯的使用有了可供研究的基礎，也為后續在白術當歸七物湯基礎上加減藥物治療CRC 提供了科學指導。

經過將白術當歸七物湯的83 個活性成分相關治療靶基因經標準化后獲得與CRC 相關的靶點共178 個，其中包括靶點為AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、JUN、CASP3 等，提示白術當歸七物湯主要可能通過作用上述基因表達蛋白發揮抗腫瘤作用。

在獲得有效成分的基礎上，通過白術當歸七物湯成分-靶點網絡分析觀察到，頻次較高的有AKT1（絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶）、IL-6（白細胞介素6）、VEGFA、MAPK3 等通路上的靶點。而GO 分析及KEGG 通路篩選顯示，共同靶點主要分布在Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Human cytomegalovirus infection、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis 等多條信號通路中。提示白術當歸七物湯可通過AKT1、IL6、VEGFA、MAPK3 等多靶點、多通路、多途徑治療CRC，且白術、當歸、茯苓、黃芪、木香、甘草、白藥蛇舌草治療CRC 具有協同作用。

AKT1 是一種絲氨酸/ 蘇氨酸激酶，是磷脂酰肌醇3- 激酶（PI3K）/AKT1 信號轉導通路下游的主要作用靶點。AKT1 在CRC 的發生發展中，活化釋放細胞存活信號，通過磷酸化激活，抑制其下游的多種作用底物，促進腫瘤細胞的生長、增殖、分化，抑制腫瘤細胞的凋亡[10]。P13K/AKT 參與腫瘤血管生成的調控，促進腫瘤血管的生成，并促進惡性腫瘤細胞的侵襲與轉移，增強腫瘤細胞對化學療法以及放射療法的抵抗性[11,12]。IL-6 是連接炎癥與腫瘤的關鍵炎癥因子[13]，并在多種腫瘤中異常表達[14]。而且通過參與多條信號通路如Janus 蛋白酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）信號通路，Ras 蛋白、細胞外信號調節激酶（ERK）及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，以及PI3K/AKT 信號通路來調控腫瘤的生長、增殖、分化、轉移及侵襲[15]。有多項研究表明抑制IL-6 對多種腫瘤有治療效果[13,16-18]。血管內皮生長（VEGF）是目前已知特異性最好、作用最強的促血管生成因子[19,20]。其中VEGFA 是其相關基因家族中在組織和細胞中含量最豐富、功能最強大的，在血管新生中起關鍵作用[19]。VEGF 可與其受體結合促進血管內皮細胞的增殖遷移，從而介導血管的生成[21]，對實體腫瘤的發生進展有重要促進作用[22]。

在我們的研究中，白術當歸七物湯仍然是通過抑制腫瘤增殖轉移、誘導凋亡、抗血管生成等經典通路發揮抗腫瘤作用，這與傳統的抗CRC 藥物如奧沙利鉑、5- 氟尿嘧啶（5-FU）、卡培他濱等藥物有相似之處。這一方面表明，使用白術當歸七物湯治療CRC具有一定的科學根據，另一方面也為我們后續針對白術當歸七物湯的藥物有效成分研究提供了基礎，有可能從中能提取抗CRC 的核心化合物而進一步開發。

總之，白術當歸七物湯是通過多靶點、多通路、多途徑治療CRC，且白術、當歸、茯苓、黃芪、木香、甘草、白藥蛇舌草治療CRC具有協同作用。進一步有待于從白術當歸七物湯中篩選出最有效的化合物成分開發運用。并在在此基礎上探索該藥物在肺癌、膀胱癌、胰腺癌及前列腺癌等惡性腫瘤中的療效。