不同外源基因拷貝數背景CHO細胞的宿主細胞蛋白種類的研究

高僑，余垚，蔡潔行

·論著·

不同外源基因拷貝數背景CHO細胞的宿主細胞蛋白種類的研究

高僑，余垚，蔡潔行

200137 上海藥明生物技術有限公司/復旦大學生命科學院遺傳工程國家重點實驗室（高僑）；200438 上海，復旦大學生命科學院遺傳工程國家重點實驗室（余垚）；200137 上海藥明生物技術有限公司（蔡潔行）

研究外源基因拷貝數、生產工藝、細胞多樣性對宿主細胞蛋白表達的影響。

構建空載體 CHO K1 細胞株，檢測其外源基因拷貝數，根據拷貝數的低、中、高對細胞進行分類。使用不同的生產工藝測試低拷貝、中等拷貝和高拷貝的細胞群，觀察其宿主細胞蛋白表達之間的差異。最后將三個拷貝數水平的細胞群進行混合，再生產，觀察其混合表達的宿主細胞蛋白與單獨生產時表達宿主細胞蛋白的差異。

研究結果顯示，不同拷貝數背景的細胞群之間表達宿主細胞蛋白相差 6% ~ 13%。相同的細胞進行不同的工藝生產時，也因為基礎培養基和補料的不同而使宿主細胞蛋白的種類不同。細胞多樣性增加并不能引起宿主細胞蛋白表達的種類增多。

宿主細胞蛋白的表達與外源基因拷貝數、生產工藝以及細胞群的多樣性有關。

CHO 細胞； 宿主細胞蛋白； 外源基因拷貝數； 生產工藝； 多樣性

中國倉鼠卵巢細胞（Chineseovary cell，CHO），是治療性蛋白在工業生產中最為常用的哺乳動物細胞。它因為易于懸浮培養，具有良好的翻譯后修飾以及折疊等功能，產物胞外分泌，產量高而成為工業生產中最受歡迎的哺乳動物細胞。而在治療性蛋白生產的過程當中，一些復雜的源于宿主細胞的蛋白也隨著治療性蛋白的表達而一起被表達出來，通常稱之為“宿主細胞蛋白”[1]，簡稱 HCPs。宿主細胞蛋白如果殘留在藥物制劑中，會引起人體的免疫應答反應，如：發熱、水腫甚至休克等[2]。藥物監管部門最關注患者用藥的安全性，因此 HCPs 的監控和殘留檢測變得越來越重要。市面上目前已經有商業化 HCPs 檢測試劑盒（Cygnus F015），但 CHO HCPs 覆蓋率僅為 40% ~ 60%[3]。因此，藥監局要求藥企在臨床 III 期使用特異性構建的空載細胞株上清制備的 ELISA 試劑盒進行 HCPs 殘留量檢測[4-5]。從側面說明 HCPs 的表達量可能與宿主類型、外源載體插入等因素相關[6]。目前對于 CHO 細胞宿主細胞蛋白表達與生產工藝的關聯，與外源基因插入拷貝數的關系；與細胞多樣性的關系研究較少。本實驗就此三方面利用野生型 CHO K1 細胞進行外源基因的轉染和篩選，開展了相關研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 本研究所使用的 CHO K1 細胞和載體均為上海藥明生物技術有限公司自主專利的產品。檢測空載質?？截悢档奶结樇耙镉嗁徲谔K州金唯智生物科技有限公司。

1.1.2 試劑和儀器 CD CHO 培養基，轉染使用的 Freestyle Max 系統、BM003H 培養基、殺稻瘟菌素、博來霉素以及細胞培養使用的 CO2靜置培養箱均購自賽默飛世爾科技有限公司；BM020H 培養基、FM020A 補料、FM016 補料購自 GE 生命科學公司；提取 DNA 使用的 DNeasy Blood &Tissue Kit 購買自美國 Qiagen 公司；細胞計數儀為 Beckman Coulter 公司產品；搖床為瑞士阿道夫科耐公司產品。

1.2 方法

1.2.1 表達外源基因的 CHO K1 空載體細胞株的建立 選用公司自主專利的空載體質粒及 CHO K1 宿主細胞，該細胞使用 CD CHO 培養基，在 36.5 ℃，6% CO2、225 r/min 轉速下進行培養。應用 FreeStyle Max 轉染系統將兩個空載體質粒 Vector 1 和 Vector 2 轉染至懸浮培養的 CHO K1細胞中。轉染后，對細胞進行活細胞密度及細胞活率的檢測，根據該結果將細胞鋪板至 96 孔板中，同時更換為篩選性培養基，篩選抗生素為博來霉素和殺稻瘟菌素。隨后定期更換新鮮篩選培養基進行篩選，培養約 2 周后，待孔板內細胞恢復，挑選恢復狀況良好的細胞進行擴增，分別逐步擴增至 24 孔板，6 孔板，最后至搖管。篩選期間，細胞在 36.5 ℃、6% CO2下進行培養。進入搖管后，依舊使用帶有篩選壓力的培養基進行傳代，并對細胞進行保種凍存，共傳 4 代。至此，能表達外源基因的空載體 CHO K1 迷你細胞群建立完成，該細胞群未進行單克隆挑選的步驟。

1.2.2 外源基因相對拷貝數的檢測 選取已知 Vector 1 和 Vector 2 絕對拷貝數的克隆細胞株作為對照。利用 qPCR 技術進行外源基因相對拷貝數的檢測。使用 DNeasy Blood & Tissue Kit 對細胞的 DNA 進行抽提備用。設計針對載體序列的引物，以 B2M 管家基因為內參，進行 PCR 擴增，最后使用 ABI 7500 PCR 儀進行檢測，7500 Software 軟件進行數據讀取和分析。引物及探針序列設計如表 1 所示。根據外源基因相對拷貝數的結果，將細胞分為低拷貝、中等拷貝和高拷貝，共 3 類。并將每一類的迷你細胞群進行混合，分別命名為 HCP mixture level 1（低拷貝）、HCP mixture level 2（中等拷貝）、HCP mixture level 3（高拷貝）三個細胞群。

1.2.3 不同生產工藝針對不同拷貝數背景的細胞群進行宿主細胞蛋白的生產 選用兩個不同的批次補料工藝 A 和 B，工藝 A 與工藝 B 的參數設置如表 2。對 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 進行批次補料實驗，批次補料期間，在補料當天，利用 Vi-CELL XR 監測期間活細胞密度和細胞活率的數值變化，考察基礎培養基和補料對三個細胞群的生長以及 HCPs 表達的影響。

表 1 引物及探針序列

1.2.4 不同多樣性細胞群進行宿主細胞蛋白的生產 將 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 三個細胞群復蘇傳代后，再次進行等密度混合，混合為一個 HCP 總細胞群，選擇表 1 中的工藝 A 進行批次補料實驗。批次補料期間，在補料當天，利用 Vi-Cell XR 監測期間活細胞密度和細胞活率的數值變化，考察細胞群多樣性對 HCPs 表達的影響。

1.2.5 宿主細胞蛋白種類的分析與對比 收獲批次補料實驗的上清，研究胞外分泌的 HCPs，2D-Gel 法進行宿主細胞蛋白種類分析。

2 結果

2.1 表達空載體 CHO K1 細胞群的篩選

本實驗成功構建了表達外源基因的空載體細胞群，可正常在帶有篩選壓力的基礎培養基中穩定傳代存活。

表 2 批次補料實驗生產工藝參數對比

2.2 不同拷貝數背景的細胞群建立

通過 qPCR 方法對成功構建的細胞群中的外源基因進行了相對拷貝數的檢測，Vector 1 和Vector 2 相對拷貝數檢測分布如圖 1 所示。根據相對拷貝數的檢測結果，將兩個載體 Vector 1 和Vector 2 拷貝數均處于 1 ~ 10 之間的細胞群混合，命名為 HCP mixture level 1；兩個載體拷貝數中，只要有一方拷貝數處于 11 ~ 20 之間，將這一類細胞群進行混合，命名為 HCP mixture level 2；兩個載體拷貝數中，只要有一方大于 21，將這一類細胞群進行混合，命名為 HCP mixture level 3。

2.3 不同生產工藝的批次補料實驗

選擇 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 三個細胞群進行批次補料實驗的研究。選用工藝 A 與工藝 B 進行批次補料實驗，培養 2 周。生長曲線如圖 2 所示。

從批次補料實驗的結果來看，不同拷貝數背景的細胞群在工藝 A 下，活率變化并沒有太大的區別，而在活細胞密度的峰值上表現出不同，分布在 19E6 ~ 25E6 cells/ml 之間。不同拷貝數背景的細胞群在工藝 B 下，活率變化也沒有太大的區別，活細胞密度的峰值相差不大，但在第 6 天后，HCP mixture level 1 和 HCP mixture level 2 還繼續維持高密度的表現，而 HCP mixture level 3 活細胞密度則開始漸漸降低。

圖 1 qPCR 技術檢測細胞群外源基因相對拷貝數分布情況

Figure 1 The relative copy number distribution of exogenous genes using qPCR

Figure 2 Growth curves of pools with different copy number backgrounds in process A (A) and B (B)

A：HCP mixture level 1 在工藝 A 下 HCPs 2D-Gel 檢測膠圖；B：HCP mixture level 2 在工藝 A 下 HCPs 2D-Gel 檢測膠圖；C：HCP mixture level 3 在工藝 A 下 HCPs 2D-Gel 檢測膠圖；D：HCP mixture level 2 在工藝 B 下 HCPs 2D-Gel 檢測膠圖

A: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 1 under process A; B: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 2 under process A; C: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 3 under process A; D: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 2 under process B

圖 3 2D-Gel 檢測膠圖

Figure 3 2D-Gel results

2 周培養結束后，收獲上清，利用 2D-Gel 方法研究胞外分泌的宿主細胞蛋白，利用 PDQuest 軟件進行 HCPs 種類的分析。結果如圖 3。PDQuest軟件分析 HCPs 種類，結果如表 3 所示。

從 HCPs 種類分析結果來看，在相同工藝 A 下，對比 HCP mixture level 1、2、3 三種拷貝數背景的 HCP 種類，HCP mixture level 2 > HCP mixture level 1 > HCP mixture level 3。以 HCP mixture level 1 為對比基準，HCP mixture level 2 較 HCP mixture level 1 種類多 84 種，占 HCPs 基準種類的 6%。HCP mixture level 2 較 HCP mixture level 3 種類多 167 種，占 HCPs 基準種類的 13%。推測不同拷貝數背景的細胞群即使是在相同的工藝下，HCPs 的種類差別也較大。

表 3 HCPs 種類分析

對比 HCP mixture level 2 在不同的工藝 A、B 中，HCPs 種類相差 92 種，占 HCPs 基準種類的7%。也可推測出，即使遺傳背景相同，不同的生產工藝也會在 HCPs 的表達上引起變化。

圖 4 HCPs 總細胞群在工藝 A 下生長曲線圖

Figure 4 Growth curves in HCPs mixed pools in process A

2.4 細胞多樣性

將 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 三個細胞群進行混合，混合后成為多樣性最多的一個細胞群，選用工藝 A 進行批次補料實驗，培養 2 周。生長數據如圖 4 所示。

從細胞生長上來看，混合后培養的活率變化與用 A 工藝單獨培養 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 時無太大差別?；罴毎芏茸兓瘓D中可看出，活細胞密度峰值達到 20E6 cells/ml，與單獨培養 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 時對比，處于中等水平。

培養 2 周結束，收獲上清，利用 2D-Gel 技術研究胞外分泌的宿主細胞蛋白的表達情況。如圖 5 所示。

經過 PDQuest 軟件分析，HCPs 總細胞群在工藝 A 下所表達 HCPs 共 1299 種。通過對比，HCPs 總細胞群與 HCP mixture level 1 相比少2 個點；與 HCP mixture level 2 相比少 86 個點，與 HCP mixture level 3 相比多 81 個點；并未出現預期中 HCPs 總細胞群所表達的宿主細胞蛋白種類為三個細胞群所表達宿主細胞蛋白種類的總和[7]。這可能是由于細胞群經過再次混合，細胞群的多樣性增加，同時細胞與細胞之間競爭變得更加激烈[8]，生長快的細胞會逐漸占據優勢，生長慢的細胞被逐漸淘汰，導致宿主細胞蛋白譜變窄，進而最終影響到宿主細胞蛋白的表達[9-13]。

3 討論

HCPs 的去除和最終產品中其含量的鑒定，在工業生產和臨床申報中是十分重要的。雖然目前市面上已經有商業化的 ELISA 試劑盒檢測產品中HCPs 的殘留，但由于其檢測HCPs 覆蓋率低，不能滿足臨床申報時 CFDA 的要求[14-15]。

圖 5 HCPs總細胞群在工藝 A 下HCPs 2D-Gel 檢測膠圖

Figure 5 HCPs 2D-Gel results of HCPs mixed pools

由于蛋白的表達可能受到外源基因插入的拷貝數、生產時所用的基礎培養基、補料、生產所用的宿主細胞類型，以及生產所用細胞的多樣性等多方面因素影響。本實驗針對以上影響因素，設計了一系列實驗，成功構建了 CHO K1 空載體宿主細胞，獲得了不同拷貝數背景的細胞群。通過對比，發現低拷貝、中等拷貝、高拷貝的細胞群在相同工藝進行生產的情況下，宿主細胞蛋白的種類差異高達 6% ~ 13%，說明外源基因的拷貝數對宿主細胞蛋白的表達的確存在影響。選取中等拷貝數背景的 HCP mixture level 2 進行不同生產工藝的 HCPs 對比，發現即使是同一株細胞，在不同的生產工藝下，HCPs 種類相差約 7%。分析原因，可能是由于基礎培養基或補料的成分中如某些氨基酸，維生素等的配比有所差別，而由于細胞群中某些細胞對某些氨基酸的消耗量要求更高，這種氨基酸的濃度缺失導致這類細胞生長及表達受到限制，細胞群中各類細胞的比例發生變化，進而影響了整體 HCPs 的種類變化[16-18]。進一步說明 HCPs 的表達實際上與生產工藝中的基礎培養基、補料等相關。

在對三個細胞群 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 進行混合后，考察 HCPs 總細胞群的宿主細胞蛋白表達情況，發現其 HCPs 表達種類有所減少，說明 HCPs 的種類并不如預期中越增加細胞群多樣性宿主細胞蛋白種類越多的設想[19-20]。由此對比市面上商業化試劑盒，該試劑盒為一個通用檢測試劑盒，試劑盒中所包含的抗 HCPs 抗體，有一些免疫原性比較弱或完全不具有免疫原性，造成其并不能很好地覆蓋產品中的 HCPs 種類，導致其特異性并不是很強，本實驗中特異性構建的空載細胞群所生產的HCPs 相對于使用同宿主 CHO K1 構建的單克隆細胞株而言，HCPs 的表達更有針對性。本實驗所構建得到的不同拷貝數背景的空載體細胞群，可根據最終產品的最終生產工藝進行選擇對應的工藝生產，得到的 HCPs 種類可能會更加接近同種 CHO K1 細胞進行產品生產時所產生的 HCPs。

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Research of the host cell protein species with different exogenous gene backgrounds in CHO cells

GAO Qiao, YU Yao, CAI Jie-xing

WuXi Biologics/State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University (GAO Qiao); State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China

This research was designed to explore the effect of exogenous gene copy number, process of production and cell diversity on host cell protein expression in CHO K1 cell pools.

We successfully developed three null cell lines of CHO K1 to detect the exogenous gene copy number levels, and classify the cells according to high, medium, low levels of gene copy number. Two processes were selected to evaluate three pools for the differential expression of HCPs. Finally, all three pools were mixed together and then the differential expression of HCPs between the mixed pools with unmixed ones were evaluated by process A.

There were around 6% to 13% difference in HCPs expression among the pools with different exogenous gene copy number backgrounds. When we used the same cell line with different processes, the host cell proteins also showed differences from each other since the basic media and feed media were not the same. The addition of pool diversity didn’t lead to the increase of host cell protein species.

The host cell protein expression is influenced by exogenous gene copy number levels, process of the production and diversity of cells.

CHO cells; Host cell proteins; Exogenous gene copy number; Production process; Diversity of pools

CAI Jie-xing, Email: cai_jiexing@wuxiapptec.com

蔡潔行，Email：cai_jiexing@wuxiapptec.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.014

(YU Yao); WuXi Biologics (CAI Jie-xing), Shanghai 200137, China

2019-11-18