艾葉揮發油抗病原微生物活性研究進展

呂豐，叢萌，沈秉正，洪宗國

·綜述·

艾葉揮發油抗病原微生物活性研究進展

呂豐，叢萌，沈秉正，洪宗國

430060 武漢大學人民醫院藥學部（呂豐、沈秉正）；430070 武漢，華中農業大學動科動醫學院（叢萌）；430074 武漢，中南民族大學藥學院（洪宗國）

艾葉為菊科蒿屬多年生草本植物艾（Levl. et Vant.）的干燥葉，植株有濃烈的香氣，除干旱及高寒地區外，在我國分布廣泛。在中醫理論中，艾是一種重要的藥用植物，是中醫艾灸療法的灸材，也作為飲片廣泛應用于臨床，具有“溫經止血、散寒止痛”的功效，在梁·陶弘景《名醫別錄》及明·李時珍《本草綱目》等多部中醫藥傳統典籍中均有收錄。

隨著現代分離提取及藥理活性評價技術的提高，對艾葉化學成分活性部位的研究取得一定進展。艾葉揮發油（volatile oils fromfolium，VOAAF）為艾葉主要活性成分，其抗菌及抗病毒活性日益為人們關注，本文綜述了 VOAAF 的化學成分及抗病原微生物活性，旨在為發掘艾的藥用價值提供理論參考，為進一步深化開發艾醫藥產業貢獻一份力量。

1 艾葉揮發油的化學成分

揮發油是艾葉抗病原微生物的主要物質基礎，然而 VOAAF 化學成分很大程度上受產地、采集期和提取工藝的影響。艾在我國分布較廣，由于氣候、水文和土壤的差異，導致品種變異，形成具有各地特色的亞種。傳統認為，艾葉采集以端午節為佳，然而含閏月年份的 24 節氣與陰歷出入較大，也與采收期光照及降雨有關，故艾葉的采集期也一定程度影響 VOAAF 的化學成分。VOAAF 常用的提取工藝包括水蒸氣蒸餾法、超臨界 CO2萃取法、溶劑萃取法和微波萃取法等。這些方法在工藝、產率、提取速度和能耗等方面均各有不同，故對 VOAAF 的化學成分也有一定影響。本小節將依產地、采集期和提取工藝三大因素對VOAAF化學成分的影響進行綜述。

1.1 產地對艾葉揮發油化學成分的影響

肖宇碩等[1]對江蘇南通、湖北蘄春、浙江臺州、云南楚雄及新疆烏魯木齊五地采集的艾葉樣本進行揮發油成分研究，發現湖北蘄春樣本揮發油含量最高；在檢出的 155 種成分中，蒎烯、桉油精、萜品烯、側柏酮、1-石竹烯和氧化石竹烯等 16 個成分為共有組分。本實驗室分別對湖北蘄春、安徽霍山、江西樟樹、山東鄄城和河北安國五個地方品種的 VOAAF 進行了化學成分分析[2]，結果發現：運用蘄艾油簡式提取法[3]所得揮發油得率分別為 1.230%、0.296%、0.479%、0.394% 和 0.675%；分別檢出 28、41、16、46 和 11 種化學成分，其中 1,8-桉葉油素、3-側柏酮、石竹烯及其氧化物和龍腦等為其共有成分。蔣瀟和田靜[4]通過比較云南、四川和湖北三地產 VOAAF 化學成分發現，三地樣品共同含有的化合物分別為樟腦、龍腦、3,3,6-三甲基-1,5-庚二烯-4-酮和 1,8-桉葉油素，然而含量差異較大。戴衛波等[5]通過對 12 個不同產地的VOAAF 分析得出：湖北、山西、河北、湖南和安徽產艾葉其揮發油含量較高；普遍含有桉油精、樟腦、龍腦、松油醇（包括 α-松油醇和順式-β-松油醇）、側柏酮和氧化石竹烯等成分。綜上，艾葉產地不同造成了揮發油的得率及主要化學成分的差異，故強調道地性為確立 VOAAF 主要化學成分的基本前提，也為研究其抗病原微生物活性指明了物質基礎。

1.2 采集期對艾葉揮發油化學成分的影響

張元等[6]以湖北蘄春 2014 年種植的艾為研究對象，對當年端午節前后一個月共 7 個時間點采收艾葉樣本進行揮發油化學成分分析，結果發現：當年 5 月 20 日前后采收樣本的揮發油含量最高，達到 1.29%；以龍腦、桉油精、樟腦等 30 種主要成分相對含量為指標，5 月 27 日采收樣本為最高，5 月 20 日采收樣本次之。本實驗室對湖北蘄春在 2012 年端午節前一個月 6 個時間點采集的艾葉進行揮發油化學成分分析發現[7]：當年 6 月 2 日采集點揮發油含量最高；通過比較不同采集期 5 種生物活性成分（1,8-桉葉油素、β-側柏酮、樟腦、龍腦、4-萜烯醇）相對含量變化，6 月 2 – 9 日采集樣本生物活性成分含量最高，毒性最低，品質較好。傳統認為，艾葉采集以端午節為佳，但動植物生長依 24 節氣變化，含閏月年份的 24 節氣與陰歷出入較大，故端午節收艾未必最佳。例如，2012 年（閏四月年）芒種節的前后采收的艾葉質量最好，既有較高的 VOAAF 得率，又可保證揮發油中生物活性成分含量的穩定性。

1.3 提取工藝對艾葉揮發油化學成分的影響

目前已報道 VOAAF 的提取方法多達十余種[8]，較為常見的有水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法和有機溶劑萃取法等。表 1 為多篇文獻報道的艾葉揮發油得率及主要化學成分。水蒸氣蒸餾法操作簡便環保，無有機溶劑殘留，在工業制備中運用廣泛；由于其工作溫度在 100 ℃左右，蒸餾出大部分可揮發性組分以小分子化合物及其氧化產物為主[9-10]。超臨界 CO2萃取法揮發油得率較高，反應界面在常溫下進行，一定程度上避免了常規提取過程中經常發生的分解、沉淀等反應；所得產物中極性較小的成分含量較高[9, 11]。運用有機溶劑萃取法揮發油得率較高，極性較小成分含量較多（如芳香族化合物），然而提取物種類較前兩種方法有限且具有溶劑殘留[12-14]。綜合來看，水蒸氣蒸餾法提取的揮發油工業推廣和臨床藥用價值更大，而超臨界流體萃取法和有機溶劑萃取法等工藝更適合于成分分析和品質鑒定。

表 1 不同提取方法制備的艾葉揮發油化學成分比較

多種因素均可顯著影響 VOAAF 的主要化學成分。VOAAF 是多組分混合物，因此，在考察 VOAAF 生物活性時，應務必將產地、采集期及提取方式等因素考慮在內，以保證研究方案的可行性、可靠性和科學性。

2 艾葉揮發油抗病原微生物活性

按大小、結構和組成等，病原微生物可分為三大類：非細胞型（病毒）、原核細胞型（細菌、支原體、衣原體和立克次體等）和真核細胞型（真菌）。近年來，VOAAF 抗病原微生物活性已經見諸報道，本小節將依病原微生物的分類來綜述 VOAAF 的生物活性及其作用機制。

2.1 艾葉揮發油的抗病毒活性

病毒是形態最微小、結構最簡單的微生物，在微生物引起的疾病中，病毒約占 75%。早期研究肯定了艾灸的抗病毒作用，而 VOAAF 作為艾葉中主要活性成分，其抗病毒活性也逐漸為人們關注。吳生兵等[15]利用水蒸氣蒸餾法提取安徽產 VOAAF，觀察到其具有抗水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）的活性，且劑量越大抑制效果越持久。一項基于 HepG 2.2.15 細胞的研究發現，水蒸氣蒸餾法提取的河南產 VOAAF 對乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）具有抑制作用；其機制是抑制 DNA 的復制，從而減少病毒表面抗原 HBsAg 及 HbeAg 表達[16]。韓軼等[17]報道，水蒸氣蒸餾法提取的湖北產 VOAAF 可通過抑制呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）形成合胞體，產生抗病毒的作用；其 IC50為 3.33 mg/L，治療指數達到 9.4。本實驗室發現，VOAAF 及其艾灸過程中產生的艾葉裂解物均發揮抗病毒作用，其中酚類成分的 O-H 鍵能夠均裂生成半醌自由基，并對甲型 H3N2 流感病毒具有抑制活性[18]。綜上，VOAAF 具有一定的抗病毒活性，但具體是其中哪一種或哪幾種化學成分具有上述活性，尚有待深入研究。此外，擴展 VOAAF 的抗病毒譜和抗病毒機制也是進一步探索的重要方向。

2.2 艾葉揮發油的抗細菌活性

由于細菌的獲得性耐藥，人們對于化學抗菌藥物的使用日趨謹慎。艾葉的天然提取物可有效抑制細菌，其主要成分 VOAAF 因其廣譜性和天然安全性具有被廣泛研究和開發的潛力[19]。雖然多地產 VOAAF 抑菌圈直徑（DIZ）、最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）等參數各異，但仍對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌表現出廣譜抗細菌活性（表 2）；其中金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的報道最多[20-28]。本實驗室前期亦探索了蘄艾揮發油抗革蘭氏陰性與陽性菌的廣譜活性[29-30]。劉先華等[20]發現，VOAAF 對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的抑制作用等同于或優于紅霉素。類似的，李志鵬等[24]發現 VOAAF 對大腸埃希菌的抑制效果強于 160 萬單位青霉素。目前已有多項研究探索了 VOAAF 的抗菌機制。楊文婷等[25]認為 VOAAF 可通過改變細菌細胞壁和細胞膜的通透性以及抑制細菌 DNA 合成來實現其抗菌作用。Guan 等[27]通過掃描電鏡發現，揮發油的活性成分可穿透細菌細胞壁到達作用靶點，最終破壞細胞壁結構起到殺滅細菌的作用。運用細胞膜熒光探針 diSC35，Xiang 等[28]發現 VOAAF 分別在 MIC 和 MBC 濃度下處理金黃色葡萄球菌，熒光信號顯著增強、培養基上清液水溶性蛋白質和鉀離子增加，提示細菌細胞膜結構被破壞，胞內物質外泄。綜上，VOAAF 的廣譜抗菌活性提示了其作為天然藥物資源的臨床藥用潛力，而相應的抗菌機制也有待進一步研究。

表 2 對艾葉揮發油敏感的病原菌分類

注：IC50：50% 抑制濃度；IC90：90% 抑制濃度；DIZ：抑菌圈直徑；MIC：最低抑菌濃度；MBC：最低殺菌濃度。

2.3 艾葉揮發油的抗真菌活性

目前常見的致病性真菌達 50 ~ 100 種，可引起人類感染性、中毒性及超敏反應性疾病[31]。臨床上，艾灸對真菌感染往往有較顯著的療效[32-33]。艾灸具有藥物作用、溫熱作用與近紅外輻射作用三大作用機制[34]，其中藥物作用與 VOAAF 相關[35]。絮狀表皮癬菌（）屬于淺部感染真菌，臨床上可致體癬、足癬、手癬和甲癬等。吳生兵等[15]發現，120 μl/ml VOAAF 作用 3 min 即可殺滅絮狀表皮癬菌。白假絲酵母菌（）又稱白色念珠菌，屬機會致病性真菌，容易引起皮膚、黏膜和內臟的急、慢性感染，其感染率和死亡率逐年上升[36-38]。研究表明，以 120 μl/ml VOAAF 作用 40 min 即可殺滅白假絲酵母菌[15]。本實驗室發現，蘄艾揮發油對白色念珠菌具有強抑制與殺滅作用，最低抑菌濃度為 0.03%[29]。施高翔等[39]通過研究發現，VOAAF 處理白假絲酵母菌出現磷脂酰絲氨酸外翻、線粒體膜電位改變和細胞核固縮或裂解等現象，菌體細胞凋亡增加，提示 VOAAF 抗白假絲酵母菌活性與誘導線粒體損傷所致的細胞凋亡有關。新型隱球菌（）屬機會致病菌，侵犯人體可引起隱球菌病，最初表現為肺部感染，最終可累及中樞神經系統及全身各臟器。吳生兵等[15]在研究中發現 VOAAF 同樣具有抗新型隱球菌活性。黑曲霉（）是曲霉屬致病菌，能侵犯機體許多部位造成肺曲霉病、全身性曲霉病、中毒和致癌。湖北產艾葉通過同時蒸餾萃取法提取 VOAAF，其對黑曲霉的 MIC 為 6.25 ± 0.36 μl/ml[27]。努爾比耶等[40]發現，新疆產 VOAAF 對黑曲霉的 MIC 為 50 μl/ml；其主要成分桉樹腦和 4-松油烯醇對黑曲霉的 MIC 分別為 50 μl/ml 和 40 μl/ml。上述工作證實了 VOAAF 的抗真菌活性并初步推測了其活性部位，指出 VOAAF 的抗真菌作用是多種成分協同、多靶點作用的結果，為日后研究 VOAAF 的抗真菌活性提示了方向。

3 結語與展望

艾在我國資源豐富、分布廣泛，在中醫診療體系中占有重要地位。為了進一步探討艾的藥用價值和產業前景，本文首次綜述了國內外對 VOAAF 抗病原微生物活性的研究。但從 VOAAF 藥物開發的角度而言，還存在諸多難點：首先，VOAAF 的化學成分復雜，各品種艾葉油成分又各有差異，難以建立如單一成分藥物類似的質量評價標準；其次，對于 VOAAF 抗病原微生物活性的機制研究深度不足，即具體哪一種或哪幾種活性成分參與了何種水平的抑菌效應，VOAAF 的體內過程如何，這是藥效學和藥代學所需解決的問題；最后，艾葉及其揮發油產業開發規模及深度不夠，少數產品如艾條、精油制品尚處于初級開發階段，艾的藥用及衛生保健價值還有待進一步發掘。VOAAF 具有抗病原微生物活性顯著、促滲作用強、安全性高等優勢，但同時在應用方面存在溶解性差、穩定性低等不足，這需要制劑與配方技術加以解決。目前，常用的如包合、凝膠和微乳等技術既可保留揮發油的藥理活性，又能在最大程度上改善物理特性。綜上，VOAAF 的基礎研究和制劑研究將為新型抗病原微生物藥物的開發提供重要理論保障。

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洪宗國，Email：hongzongguo@aliyun.com

2019-06-12

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.022