組織胃泌素、環(huán)氧化酶2及外周血淋巴細(xì)胞檢測水平的主成分分析-決策樹模型對胃癌術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的診斷價值

汪斌 林萍

(銅陵市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 銅陵 244000)

胃癌是臨床常見消化道惡性腫瘤，發(fā)病率、死亡率均較高，嚴(yán)重威脅人類的身體健康，為提高胃癌診治效率，判定患者預(yù)后，臨床生物標(biāo)志物的選擇至關(guān)重要〔1，2〕。胃癌臨床標(biāo)志物眾多，如胃泌素(GAS)、環(huán)氧化酶(COX)-2、癌胚抗原、糖類抗原、外周血淋巴細(xì)胞血小板等〔3～5〕，胃癌組織可高表達(dá)GAS、COX-2，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增長，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力，而癌癥患者機(jī)體異常炎性反應(yīng)可增加中性粒細(xì)胞、血小板水平，促進(jìn)腫瘤血管新生、腫瘤細(xì)胞遷移等，從而加快癌癥進(jìn)展。盡管各指標(biāo)均可一定程度評估胃癌術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等，但單一指標(biāo)水平波動性較大，靈敏度較低，臨床上聯(lián)合指標(biāo)診斷成為趨勢。聯(lián)合診斷各指標(biāo)間相互干擾，考察變量較多，數(shù)據(jù)量極大，顯著增加了診斷難度，而主成分分析(PCA)則是將多指標(biāo)進(jìn)行降維處理，簡化復(fù)雜因素，并借助決策樹選擇最佳分辨節(jié)點，建立診斷模型和進(jìn)行預(yù)測分析〔6〕。目前鮮有關(guān)于PCA-決策樹模型對胃癌術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后的診斷報道，現(xiàn)借助該模型評估組織GAS、COX-2及外周血淋巴細(xì)胞檢測水平的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性收集銅陵市人民醫(yī)院2015年1月至2016年8月收治的60例胃癌患者，獲取患者胃癌組織及癌旁組織。年齡60～85歲，男38例，女22例。胃腺癌44例，男29例，女15例；胃間質(zhì)細(xì)胞瘤3例，男1例，女2例；印戒細(xì)胞癌13例，男8例，女5例。轉(zhuǎn)移20例，死亡7例。患者入院后均簽署知情同意書。

入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國胃癌診治指南》中關(guān)于胃癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕，且經(jīng)組織病理學(xué)、影像學(xué)檢查確診。②年齡≥60歲，術(shù)前未接受放療。③入組前1個月內(nèi)無凝血功能障礙、活動性出血、患者臨床資料及病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①淋巴結(jié)組織樣本檢測結(jié)果提示陽性或存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②重度感染者，未合并其他器官惡性腫瘤；③缺乏隨訪資料，耐受性較差。

1.2方法 數(shù)據(jù)收集：收集患者臨床資料，主要包括性別、年齡、腫瘤類型、腫瘤分化程度。同時檢測患者血常規(guī)，包括淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板計數(shù)，并計算患者術(shù)前外周血小板與淋巴細(xì)胞比值(PLR)、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(NLR)免疫組織化學(xué)染色檢測胃癌組織和癌旁組織GAS、COX-2表達(dá)水平。具體操作如下：獲取胃癌組織和癌旁組織標(biāo)本后用甲醛(10%)固定，依次石蠟包埋、切片、脫蠟及水化等操作，置于pH=6的檸檬酸緩沖溶液后，放入微波中開始抗原修復(fù)，接著加過氧化氫溶液(3 ml/L)孵育10 min，滴加稀釋后的GAS抗體(1∶500)、COX-2抗體(1∶800)，4℃過夜孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔、抗小鼠二抗，37 ℃孵育30 min，隨后依次進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復(fù)染、樹脂封片，染色結(jié)果由經(jīng)驗豐富的醫(yī)師閱片。免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)〔8〕：陽性染色強(qiáng)度為無染色(0分)、黃色顆粒(1分)、棕黃色顆粒(2分)、棕褐色顆粒(3分)；陽性細(xì)胞計數(shù)：10個視野中選取100個細(xì)胞，陽性細(xì)胞計數(shù)≤10%(1分)、10%<陽性細(xì)胞計數(shù)≤50%(2分)、50%<陽性細(xì)胞計數(shù)≤75%(3分)、陽性細(xì)胞數(shù)>75% (4分)。

1.3陽性限值 PLR、NLR陽性判定：以患者PLR、NLR中位數(shù)為臨界值，高于臨界值則為陽性，否則為陰性〔5〕。胃癌組織GAS、COX-2陽性判定：陽性標(biāo)記分值=陽性染色強(qiáng)度分值×陽性細(xì)胞數(shù)分值，若分值≥4分，則判記為陽性，否則為陰性〔8〕。

1.4PCA-決策樹模型 決策樹分析的生長方法采用χ2自動交互檢測，分割樣本驗證，設(shè)置最大樹深度為3，設(shè)置合并類別、拆分節(jié)點為0.05。提取主成分后便可建立PCA-決策樹模型。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件抽取 70%患者為訓(xùn)練集，剩余30%為檢測集，比較決策樹、PCA-決策樹模型對胃癌術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的診斷價值。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行χ2及t檢驗，采用Medcalc軟件繪制與分析受試者工作特征(ROC)曲線，并計算ROC曲線下面積(AUC)和對應(yīng)的P值。

2 結(jié) 果

2.1胃癌患者各指標(biāo)陽性率 60例胃癌患者術(shù)前外周血PLR、NLR分別為141.37±68.53、2.42±1.28，陽性率41.67%、38.33%。胃癌組織GAS陽性率(81.67%)、COX-2陽性率(61.67%)顯著高于癌旁組織GAS與COX-2陽性率(63.33%、28.33%，χ2=5.060,P=0.025;χ2=13.470,P=0.000)。

2.2各指標(biāo)與胃癌術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 隨訪3年共有20例(33.33%)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移納入轉(zhuǎn)移組，余40例納入未轉(zhuǎn)移組。轉(zhuǎn)移組胃癌組織GAS、COX-2分值及外周血PLR、NLR水平均顯著高于未轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，見表1。

表1 各指標(biāo)與胃癌術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.3各指標(biāo)與胃癌術(shù)后預(yù)后的關(guān)系 隨訪3年共有7例(11.67%)患者死亡納入死亡組，余53例納入存活組，死亡組胃癌組織GAS、COX-2分值及外周血PLR、NLR水平均顯著高于存活組(P<0.05)，見表2。

表2 各指標(biāo)與胃癌術(shù)后預(yù)后的關(guān)系

2.4胃癌術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的ROC曲線 GAS、COX-2、PLR、NLR均對胃癌術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有診斷價值。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、死亡的單項檢測以COX-2診斷價值最高，各指標(biāo)的AUC、95%置信區(qū)間(CI)、敏感度(%)、特異性(%)數(shù)值見表3、4，圖1、2。

表3 各指標(biāo)對胃癌術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價值

表4 各指標(biāo)對胃癌術(shù)后預(yù)后的診斷價值

圖1 各指標(biāo)評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

圖2 各指標(biāo)評估預(yù)后的ROC曲線

2.5血清指標(biāo)的PCA 以血清GAS、COX-2、PLR、NLR提取主成分(PC)，按特征值>1提取第1、第2 PC(PC1/PC2)，兩者包含原始數(shù)據(jù)73.54%的綜合信息，具體方程如下：PC1=0.258×GAS+0.310×COX-2+0.047×PLR+0.046×NLR，PC2=-0.087×GAS-0.062×COX-2+0.576×PLR+0.604×NLR。4個指標(biāo)聯(lián)合診斷的PC1/PC2 AUC分別為0.823、0.841，靈敏度分別為86.67%、83.33%，特異性均為93.33%，表明PC1/PC2均有相近的診斷效能。

2.64種胃癌相關(guān)指標(biāo)聯(lián)合2種決策樹模型的診斷效能比較 以COX-2進(jìn)入決策樹模型(χ2=10.232，P=0.000)，提取PC1/PC2建立4種指標(biāo)聯(lián)合PCA-決策樹模型，比較兩種模型對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后的診斷、預(yù)測準(zhǔn)確率，見表5，6。

表5 2種決策樹模型對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測準(zhǔn)確率比較

表6 2種決策樹模型對預(yù)后的預(yù)測準(zhǔn)確率比較

3 討 論

胃癌的發(fā)生與幽門螺桿菌感染、環(huán)境飲食因素及遺傳等密切關(guān)聯(lián)，目前臨床根治方案以手術(shù)切除治療為主，但由于胃癌早期臨床癥狀不顯著，導(dǎo)致一旦確診為晚期，患者往往錯過了最佳治療時期，且常常伴隨病灶轉(zhuǎn)移(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，增加治療難度和死亡風(fēng)險，因此提高胃癌早期檢出率對于胃癌的治療至關(guān)重要〔9，10〕。胃癌的發(fā)生、發(fā)展具有階段性、連續(xù)性，整個過程涉及細(xì)胞黏附因子、生長因子及其受體的異常分泌、DNA修復(fù)基因及抑癌基因等的異常表達(dá)，其中包含大量的胃癌診斷標(biāo)志物。其中GAS是由胃竇部的G細(xì)胞合成分泌的肽類激素，其在胃癌組織中高表達(dá)，可與受體特異性結(jié)合而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，通過干擾GAS的表達(dá)可有效抑制腫瘤生長，誘導(dǎo)凋亡〔11〕。COX-2作為花生四烯酸合成前列腺素過程中的限速酶，胃黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死、癌變均可誘導(dǎo)其表達(dá)，而COX-2的高表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，從而加快癌癥進(jìn)展〔4〕。本研究結(jié)果顯示胃癌組織GAS、COX-2表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組織(P<0.05)，與封蘭蘭等〔3，4〕研究一致，即GAS、COX-2均在胃癌組織中高表達(dá)，從而增加腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展，與胃癌的臨床病理特征(浸潤程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 )具有顯著相關(guān)性。同時研究結(jié)果表明組織GAS、COX-2水平及外周血PLR、NLR水平與胃癌術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后均有相關(guān)性，各指標(biāo)水平越高則患者進(jìn)展越差。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為評估胃癌預(yù)后的重要指標(biāo)，患者淋巴結(jié)受到腫瘤細(xì)胞侵犯，則免疫系統(tǒng)受到干擾，腫瘤組織的中性粒細(xì)胞水平大量增加，其分泌大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，促進(jìn)腫瘤組織血管新生和腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔5〕。腫瘤細(xì)胞釋放的炎性因子可導(dǎo)致血小板水平異常升高，血小板可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管新生、生長因子釋放等，加速腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移，故淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血PLR、NLR水平顯著高于未轉(zhuǎn)移患者。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者不良預(yù)后(復(fù)發(fā)、死亡)密切關(guān)聯(lián)，因此盡早采用影像學(xué)評估胃癌轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)風(fēng)險，指導(dǎo)醫(yī)生手術(shù)方式、藥物治療方案的選擇，有利于預(yù)后評估。

盡管各項指標(biāo)或標(biāo)志物可一定程度評估患者疾病進(jìn)展，但單一指標(biāo)檢測容易受到患者飲食習(xí)慣、身體狀態(tài)、伴隨疾病等因素的干擾，且患者不同進(jìn)展其水平波動性較大，從而造成假陽性或假陰性，降低診斷靈敏度〔12〕。本次實驗各指標(biāo)單獨診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者死亡時，均以COX-2診斷價值最高，其中PLR、NLR診斷效能相對較低，例如NLR診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移靈敏度僅為66.67%，鑒于單項指標(biāo)對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后診斷的局限性，因此本次實驗嘗試各指標(biāo)的聯(lián)合檢測并進(jìn)行評估。多指標(biāo)聯(lián)合檢測時，各指標(biāo)間存在復(fù)雜的相互作用，且數(shù)據(jù)量極大，增加了診斷難度，而PCA作為一種數(shù)據(jù)分析方法，可對高維空間變量進(jìn)行降維處理，從而將多指標(biāo)簡化為2個主PC在保證數(shù)據(jù)信息最少缺失前提下達(dá)到簡便、快速、準(zhǔn)確的分析效果，非常適合大樣本、大數(shù)據(jù)分析〔12～14〕。本研究采用PCA對胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后進(jìn)行分析，可揭示轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移、死亡與存活患者間的空間分布差異，并利用疾病相關(guān)指標(biāo)參數(shù)成功構(gòu)建患者的PCA特征譜，將胃癌組織GAS、COX-2水平及外周血PLR、NLR水平等指標(biāo)建成二維PCA模型，研究結(jié)果表明PCA-決策樹模型診斷價值顯著，可為胃癌術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的輔助診斷、治療、預(yù)測提供新思路。決策樹分析作為一種數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，利用概率分析原理尋找最佳分類節(jié)點，并以此分層遞進(jìn)，直至所有子集包含同一類型數(shù)據(jù)，從而增加數(shù)據(jù)直觀性，減少主觀診斷，保證數(shù)據(jù)樣本數(shù)據(jù)穩(wěn)定性〔14，15〕。同時建立PCA-決策樹模型，有效消除數(shù)據(jù)間干擾，減少指標(biāo)選擇的工作量，最終保證診斷效率。當(dāng)然此次研究納入樣本例數(shù)較少，可能存在一定程度偏倚，影響預(yù)測準(zhǔn)確率，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析。