miR-302b-3p靶向AKT1調節皮膚成纖維細胞衰老的作用機制

楊心妮 魯晴 張鑫 賀錦橋 梁偉兵 黃高翔 蘇曉雪 黎靜

(廣西醫科大學 1基礎醫學院生理學教研室，廣西 南寧 530021；2第八附屬醫院3D打印中心)

皮膚是人體最大的器官，隨著人體年齡的增長，皮膚也像其他器官一樣功能減弱并引起各種病變，逐漸出現皮膚老化狀態。miRNAs參與調節機體的多種功能，在皮膚衰老的過程中扮演重要角色。本研究將探討miR-302b-3p靶向絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)1基因表達調節皮膚成纖維細胞衰老的分子機制。

1 材料和方法

1.1復制性細胞衰老模型的建立 采用酶消化法，將5～7 d的昆明乳鼠(廣西醫科大學動物實驗中心提供)背部皮膚組織剪成小塊，用0.1%Ⅰ型膠原酶消化1.5 h，離心收集細胞加入含15%胎牛血清的高糖DMEM培養液置于培養瓶中培養。分別取連續培養第2代(P=2)及第15代(P=15)的皮膚成纖維細胞，第2代(P=2)作為對照組細胞，第15代(P=15)作為自然衰老組細胞。

1.2Real-time PCR檢測miR-302b-3p的表達 各組細胞按照Trizol試劑盒說明書步驟提取細胞總RNA，采用紫外分光光度計測A260/A280，比值處于1.8～2.1之間。按照miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒〔生工生物工程(上海)公司〕說明書操作，逆轉錄合成cDNA，cDNA 1∶10稀釋后，進行realtime PCR分析，每樣本3個重復，PCR步驟：95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環。以U6為miRNA內參標準，mmu-miR-302b-3p上游引物由生工生物工程(上海)公司合成，其序列為：GCGGTAAGTGCTTCCATGTTTTAGTAG。

1.3細胞轉染及轉染效率檢測 將皮膚成纖維細胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養基的6孔板中，接種的細胞數約為5×105/孔。次日細胞匯合度達到70%～80%時，按照Lipofectamine RNA imax 的說明書操作，分別給予細胞轉染NC、模擬物(mimic)及抑制劑(inhibitor)。繼續培養48 h進行后續實驗。

1.4RT-PCR法檢測靶基因 提取各組細胞總RNA，紫外線分光光度儀測定吸光度，并計算RNA含量。取2 μg RNA采用逆轉錄酶(AMV)進行逆轉錄合成cDNA后，采用SYBR Green熒光染料進行PCR擴增，每組3個復孔。PCR反應步驟：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 1 min，共40個循環。引物序列為：GAPDH上游引物5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；下游：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′；AKT1上游：5′-TGTGAAGGAGGGTTGGCTGC-3′，下游：5′-ACTGCGCCACAGAGAAGTTGTT-3′。

1.5Western印跡法分析AKT1蛋白表達情況 各組細胞轉染48 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，每孔加入蛋白裂解液后，反復吹打，使細胞充分裂解，95～100℃煮沸10 min，10 000 r/min離心10 min，收集的上清液即為樣本蛋白。順序加樣，待電泳分離完全后，采用濕轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，TBST充分洗膜后加入特異性一抗β-actin(1∶10 000 稀釋)及AKT1(1∶1 000稀釋) 。4℃過夜孵育，二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h，充分洗膜后加電化學發光(ECL)液顯影，凝膠成像儀自動曝光，并分析灰度值，每個樣本重復3次。

1.6統計學分析 采用SPSS11.5 軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1miR-302b-3p在復制性衰老細胞中的表達情況 與對照組相比，衰老組細胞中miR-302b-3p的表達顯著上調，差異有統計學意義(1.00±0.00 vs 5.27±0.41,P<0.01)。

2.2miR-302b-3p mimic及inhibitor 轉染后細胞miR-302b-3p的表達 與NC組(1.00±0.00)比較，miR-302b-3p mimic干預后細胞中miR-302b-3p表達顯著升高，差異有統計學意義(88.92±20.53，P<0.01)；miR-302b-3p inhibitor干預后細胞中miR-302b-3p表達顯著降低，差異有統計學意義(0.53±0.17，P<0.05)。

2.3miR-302b-3p促進皮膚成纖維細胞的衰老 與NC組〔(4.20±0.83)%〕比較，miR-302b-3p mimic轉染后皮膚成纖維細胞衰老染色陽性細胞數目顯著增加〔(10.80±2.58)%,P<0.05〕；反之，miR-302b-3p inhibitor轉染后皮膚成纖維細胞衰老染色陽性細胞數目無明顯增加〔(4.00±1.58)%,P>0.05〕。見圖1。

2.4miR-302b-3p的靶基因預測 通過生物信息學軟件Targetscan對miR-302b-3p靶基因進行預測分析。分析結果表明miR-302b-3p可與AKT1的3′-UTR靶向結合。見圖2。提示AKT1是miR-302b-3p的預測靶基因。

2.5miR-302b-3p對靶基因AKT1 mRNA的調節作用 與NC組(1.00±0.00)比較，miR-302b-3p mimic干預后細胞中AKT1 mRNA表達顯著降低，差異有統計學意義(0.58±0.12，P<0.05)；miR-302b-3p inhibitor干預后細胞中AKT1 mRNA表達顯著升高，差異有統計學意義(2.03±0.42，P<0.01)。

2.6miR-302b-3p對AKT1蛋白表達的影響 NC組，miR-302b-3p mimic 200 nmol/L、100 nmol/L、50 nmol/L組，miR-302b-3p inhibitor 100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L組AKT1蛋白表達量分別為：29.61±1.57、7.16±1.01、12.04±1.19、10.01±1.04、11.04±0.87、21.15±1.21、40.12±1.71。當皮膚成纖維細胞上調miR-302b-3p的表達時，AKT1蛋白表達顯著減少，差異有統計學意義(P<0.01)，而且呈現一定的劑量依賴性。當皮膚成纖維細胞下調miR-302b-3p的表達時，AKT1的蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，而且呈現一定的劑量依賴性。見圖3。

圖1 miR-302b-3p干預后皮膚成纖維細胞衰老染色情況(×100)

圖2 TARGETSCAN預測miR-302b-3p與靶基因的靶向結合示意圖

1～3:miR-302b-3p mimic 200、100、50 nmol/L組；3～6：miR-302b-3p inhibitor 100、200、300 nmol/L組；7：NC組

3 討 論

衰老是指隨著時間的推移個體發生功能性和器質性衰退的漸進過程。皮膚衰老在細胞、分子水平可表現為染色體端粒縮短、DNA甲基化水平下降、EGF等生長因子及其受體減少，進而使皮膚細胞增殖分化能力減弱、新陳代謝減緩等〔1〕。miRNAs 是長度約為22 nt單鏈的非編碼小分子RNA，miRNA雖然不具有編碼功能，但是能在轉錄后起作用調控基因的表達。miRNAs可參與許多主要的細胞生物學過程，如機體生長、發育、增殖與分化、能量代謝、衰老、炎癥反應等，它通過直接結合mRNA而抑制翻譯或者直接降解mRNA阻礙翻譯〔2〕，從而參與細胞的多種生理和病理過程，如細胞分化、增殖、凋亡及腫瘤形成等〔3.4〕。因此，miRNAs能通過多種途徑影響機體的衰老過程〔5〕。

miR-302b-3p在胚胎干細胞中首次發現具有調節自我更新和增殖特性等功能〔6〕。在人子宮內膜癌細胞中，miR-302b-3p的過表達通過抑制B細胞淋巴瘤(BCL)-2的表達水平，增加BCL-2 相關蛋白(BA)XmRNA和蛋白水平的表達，從而加速細胞凋亡〔7〕。本研究證實miR-302b-3p在復制性細胞衰老中表達顯著升高，而且能夠顯著促進皮膚成纖維細胞的衰老，進一步提示miR-302b-3p可能是調節皮膚成纖維細胞衰老的重要miRNA。

AKT信號轉導通路是調控衰老的重要信號通路之一〔8,9〕。細胞衰老過程中，能夠通過磷脂酰肌醇-3-激酸酶(PI3K)信號通路的激活來提高氧化應激產物活性氧(ROS)的堆積從而影響人皮膚成纖維細胞的衰老〔10〕。有研究表明PI3K-AKT/mTOR 信號通路能夠調控人血管內皮細胞的復制性衰老〔11〕。miR-30b可通過抑制AKT1的表達調控干細胞的多能性、畸胎瘤的形成和分化〔12〕。已有實驗證實miR-302b可以靶向抑制肝癌細胞中AKT2的表達來抑制肝癌細胞的侵襲和轉移〔13〕，本研究表明miR-302b-3p可能通過與AKT1的3′-UTR靶向結合，抑制皮膚成纖維細胞中AKT1 mRNA及蛋白質的表達，從而促進皮膚成纖維細胞的衰老。

綜上所述，衰老過程中皮膚成纖維細胞miRNA-302b-3p的表達升高，miRNA-302b-3p可能通過靶向抑制AKT1基因及蛋白的表達，從而加速皮膚成纖維細胞的衰老過程。