甘藍型油菜脂肪酶基因BnGLIP1的克隆與分析

李明 丁麗娜 王政 曹維 王玉康 張潔夫 譚小力

摘要：植物GDSL脂肪酶是一個重要的脂肪酶家族，具有水解酶活性，在植物體內參與眾多的生理活動。從甘藍型油菜中克隆到1個GDSL類型脂肪酶基因，將其命名為BnGLIP1。該脂肪酶基因編碼的蛋白有360個氨基酸，含有20種氨基酸，分子質量為39 545.35 u，理論等電點為4.95。生物信息學分析表明，該蛋白屬于穩定性蛋白，可能為親水性蛋白;編碼蛋白的N端具有信號肽序列，推測可能為外分泌蛋白;蛋白質二級和三級結構顯示α螺旋和無規則卷曲所占比例較高。組織特異性表達分析表明，BnGLIP1在甘藍型油菜的根、莖、莖尖、葉、花、角果、種子等中均有表達，其中角果中的表達量最高，莖中最低。干旱、高鹽等脅迫處理均能誘導BnGLIP1的表達，表明BnGLIP1脂肪酶基因在植物的脅迫響應中發揮作用。

關鍵詞：甘藍型油菜;BnGLIP1;生物信息學;表達模式分析;脅迫響應

中圖分類號： S634.301;Q785文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0059-06

收稿日期：2019-03-05

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2016YFD0100305）。

作者簡介：李?明（1993—），女，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向為模式生物功能基因組學和蛋白質組學。E-mail：LMING0309@126.com。

通信作者：譚小力，博士，研究員，研究方向為油菜功能基因組學。E-mail：xltan@ujs.edu.cn。

油菜是繼水稻、小麥、玉米和大豆之后的第五大農作物，主要分布在長江流域，屬于十字花科，主要分為三大類型，即白菜型油菜、芥菜型油菜和甘藍型油菜。其中甘藍型油菜（Brassica napus L.）是我國重要的油料作物，油菜籽中除含有豐富的油脂外，還含有豐富的蛋白質，是一種潛在的植物蛋白資源[1]。此外，油菜又是生物柴油的理想原料，是一種優質能源，油菜生產對保障我國食用油安全供給有重要意義，同時對發展生物能源也有潛在價值[2]。

GDSL脂肪酶是具有多功能性質的水解酶，在多種植物體中均有發現[3-6]。近年來許多研究發現，GDSL在植物生長發育、器官形態發生、逆境脅迫和脂代謝等方面發揮著重要作用[7-10]。譬如，BnLIP2在油菜的種子萌發、形態建成及開花過程中起著重要作用[11]。Takahashi等鑒定到了1個擬南芥CDEF1（cuticle destructing factor 1）基因，該基因表達的蛋白屬于GDSL脂肪酶/酯酶家族，參與花粉管穿透柱頭并且可促進側根的形成[12]。此外，Kim等研究發現，擬南芥glip1-1突變體在接種壞死病原菌后表現出誘導抗性缺陷，而在過表達GLIP1基因植株中則表現出對多種病原菌的抗性[13]。與野生型植株相比，AtGDSL1和BnGDSL1過表達株系的種子發芽率和成 苗率均有提高，與此同時，AtGDSL1和BnGDSL1的組成性過表達促進了脂肪分解代謝，降低了種子油含量[14]。另外，Chen等研究表明，GDSL脂酶家族成員可以通過降解脂肪酸而影響種子脂肪酸的含量[15]。在油菜中過表達棉花基因GhGLIP后，顯著提高了油菜種子中的油脂含量[16]。

與微生物、動物GDSL脂肪酶研究相比，植物中該類脂肪酶的研究較少，尤其是關于油料作物脂肪酶基因，有很多問題亟待發現和研究。本研究從甘藍型油菜中分離得到了1個GDSL脂肪酶基因（BnGLIP1），進一步對其進行生物信息學分析及表達分析，預測其結構與功能，為深入研究其生化功能打下基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料與試劑

1.1.1?植物材料

甘藍型油菜中雙11號種子購于武漢中油種業科技有限公司，培養室生長條件如下：溫度為（20+2） ℃，濕度為60%～90%，每天光周期為光照8 h/黑暗16 h，光照度為150 μmol/（m2·s）。生長15 d后分別取幼苗的根、葉、莖和莖尖，另外在開花7 d后取新鮮的花，待開花30 d后取幼嫩的角果和種子，將所取材料置于-70 ℃ 冰箱備用。

1.1.2?試劑

TRIzolTM Reagent，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;DH5α化學感受態細胞、HiScript Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉錄試劑盒、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit，購自Omega Bio-Tek公司;KOD-Plus-Neo高保真酶，購自東洋紡（上海）生物科技有限公司;pMDTM18-T Vector克隆試劑盒，購自寶日醫生物技術（北京）有限公司。

1.2?試驗方法

1.2.1?油菜總RNA提取以及cDNA合成

采用Trizol試劑快速提取法提取油菜總RNA。首先取少量組織用液氮速凍，研磨至粉末狀，之后加入1 mL預冷的Trizol，充分混合后冰上靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。待完成后，取約800 μL 上清加入300 μL三氯甲烷并劇烈振蕩，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。隨后取上清加入等體積異丙醇輕搖，4 ℃、12 000 r/min離心10 min;棄上清加入75%乙醇充分洗滌，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。最后棄上清，干燥沉淀，加入DEPC水溶解，-70 ℃保存備用。

cDNA合成是以總RNA為模板，采用反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成第1鏈。

1.2.2?序列克隆

根據BnaC07g35650D序列設計引物進行克隆，擴增BnGLIP1的引物序列如下：OL-F：5′-GGATAAGGTTTTTTCCAGAGAG-3′和OL-R：5′-TCTTTGTCTGTGTGGAGGAA-3′。以甘藍型油菜中雙11號的cDNA為模板，使用高保真聚合酶KOD-Plus-Neo進行目的片段擴增，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收擴增產物，并將產物連接到pMD18-T載體從而構建成為BnGLIP1-pMD18-T載體，之后轉化進大腸桿菌DH5α感受態細胞，并將陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.3?蛋白生物信息學分析

利用Primer 5軟件預測目的基因BnGLIP1編碼的氨基酸序列;蛋白的理化性質利用在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）進行分析;利用NCBI中的CDD數據庫[17]對蛋白保守結構域進行預測;使用MEGA 5.1軟件進行多種氨基酸序列比對;利用ProtScale分析蛋白的親疏水性;運用SignalP 4.1 Server對蛋白序列的信號肽進行預測;運用TargetP 1.1 Server預測真核細胞蛋白的亞細胞定位[18];利用SOPMA和SWISS-MODEL分別對蛋白的二級結構和三級結構進行預測。

1.2.4?環境脅迫處理

選用生長至4葉1心期的油菜幼苗進行不同環境脅迫模擬處理。干旱脅迫處理：用聚乙二醇（PEG）溶液模擬干旱，將濃度為20%（W/V）的PEG溶液噴施于油菜葉片上，黑暗培養24 h。鹽脅迫處理：將濃度為25 mmol/L的NaCl溶液噴施于油菜葉片上，黑暗培養24 h。低溫、高溫脅迫處理：分別將油菜置于4 ℃冰箱和37 ℃培養箱，黑暗培養24 h。以室溫下正常生長的幼苗作為對照。上述每種處理均設置3個生物學重復。

1.2.5?表達分析

根據BnGLIP1基因序列的非保守區設計實時熒光定量PCR引物，引物序列如下：qPCR-F：5′-AGATTCCTTTGCCAACGACC-3′和qPCR-R：5′-ACCCTAAACCCATAGCGAGA-3′，選取甘藍型油菜Actin基因（GenBank：AF111812.1）作為內參基因，內參引物序列如下：Actin-RTF：5′-TGTTGCTATCCAGGCTGTTCTTTC-3′和Actin-RTR：5′-GATAGCGTGAGGAAGAGCATAACC-3′。以反轉錄第1條鏈cDNA為模板，具體操作方法根據AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明書進行，試驗數據采用GraphPad Prism 7軟件進行分析。

2?結果與分析

2.1?甘藍型油菜BnGLIP1基因的全長cDNA克隆

本研究從甘藍型油菜中雙11中分離得到了BnaC07g35650D的全長cDNA，核苷酸序列和預測的氨基酸序列如圖1所示，該序列的開放閱讀框長1 083 bp，編碼360個氨基酸，將克隆到的基因命名為BnGLIP1（B.napus GDSL LIPASE-LIKE1）。

2.2?蛋白性質的生物信息學分析

2.2.1?蛋白理化性質分析

利用ProtParam進行蛋白的理化性質預測，分析結果顯示BnGLIP1蛋白由360個氨基酸組成，分子式為C1 741H2 663N483O536S19，分子質量為39 545.35 u，理論等電點為4.95，此蛋白由20種氨基酸組成，其中所占比例最高的3個氨基酸為Ala（8.9%）、Asn（8.9%）和Gly（9.2%），帶負電荷的殘基總數（Asp+Glu）為34個，帶正電荷的殘基總數（Arg+Lys）為25個。

2.2.2?蛋白保守結構域分析

與其他脂酶（lipase）相似，GDSL類脂酶同樣以絲氨酸作為水解催化位點，但不同的是絲氨酸位于蛋白N端。此外，GDSL脂酶還具有至少4個保守的結構區域（block）[6]。利用NCBI的CDD數據庫預測BnGLIP1蛋白的保守結構域特征，結果顯示此蛋白屬于植物SGNH脂肪酶家族（圖2）。使用MEGA 5.1軟件對來自不同物種的氨基酸進行序列比對，發現甘藍型油菜BnGLIP1蛋白具有很高的保守性，其中它與擬南芥中的同源蛋白（AAL24090.1）同源性最高，為90.83%，其次為另一種擬南芥同源蛋白（NP_199379.1），同源性為81.94%。如圖3所示，BnGLIP1具備GDSL脂肪酶的序列特征，一級結構主要包括5個保守區域（Ⅰ～Ⅴ）。

2.2.3?蛋白的親疏水性預測

甘藍型油菜BnGLIP1蛋白由360個氨基酸組成，為進一步了解編碼蛋白的親疏水性，利用ProtScale對其進行詳細分析發現，雖然某些氨基酸表現出較強的疏水性，但親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，因此可以預測此蛋白為親水性蛋白（圖4）。

2.2.4?信號肽分析以及亞細胞定位預測

如圖5所示，運用SignalP 4.1 Server對蛋白序列的信號肽進行預測，發現前21個氨基酸的信號肽（S）值處于最高，在0.637～0.943之間浮動，并且在第22個氨基酸處驟降至0.137，之后處于一個平穩水平;在第22個氨基酸處出現剪切位點（C）最高值0.877;Y值也在第22個氨基酸處出現最高值。由此可知，此BnGLIP1 蛋白有信號肽序列?推測其可能為外分泌蛋白。另外，利用TargetP 1.1 Server對其進行亞細胞定位預測，定位依據的是任何一個N-末端存在序列，如葉綠體轉運肽、線粒體靶向肽或分泌途徑信號肽等。分析結果顯示，分泌途徑中的信號肽（SP）數值為0.976，并且可靠指數RC為1，表明其為一個分泌蛋白（表1），定位在細胞外。根據以上預測結果分析，推測BnGLIP1很可能是一個分泌蛋白。

2.2.5?二級、三級結構預測

氨基酸序列決定了蛋白質的二級、三級結構，蛋白質結構決定了其功能。為了探討BnGLIP1蛋白質結構，利用SOPMA在線分析軟件對其二級結構進行預測。如圖6所示，α螺旋（藍色）占38.06%，延伸鏈條（紅色）占16.11%，β轉角（綠色）占3.61%，紫色代表無規則卷曲，占42.22%（圖6）。該結果與SWISS-MODEL軟件進行的三級結構的預測結果相吻合（圖7）。

2.3?BnGLIP1基因表達模式分析

2.3.1?組織特異性表達分析

采用qRT-PCR技術檢測BnGLIP1在甘藍型油菜不同組織包括根、莖、葉、花、莖尖、角果、種子中的表達模式，結果發現此基因在各個組織中均有表達，但在各個組織中的表達量存在顯著差異。其中以根作為對照，基因在角果中的表達量最高，約是根中表達量的8.95倍，在葉和莖中表達量相對較低（圖8）。

2.3.2?各種環境因子對BnGLIP1表達的影響

qRT-PCR分析顯示，在PEG溶液處理24 h時，與對照（CK）相比，BnGLIP1的相對表達量顯著提高。25 mmol/L NaCl處理也可以誘導BnGLIP1的表達。另外，在4 ℃低溫、37 ℃高溫處理條件下，BnGLIP1的相對表達量下降（圖9）。這些結果表明，BnGLIP1可能參與植物對環境脅迫的應答反應。

3?討論與結論

甘藍型油菜是我國及世界上最重要的油料作物之一。植物脂肪酶具有廣泛的生理功能，能催化水解反應，還可能催化酯化、醇解、酸解等多種反應，在油脂分解反應及油脂改造中具有潛在應用價值。

本研究以我國長江中下游油菜主產區具有優良抗逆特點的甘藍型油菜品種中雙11號為材料，克隆了1個重要的GDSL脂肪酶基因BnGLIP1，并通過生物信息學方法分析了其基本理化性質以及結構特點等。利用NCBI的CDD數據庫分析發現，BnGLIP1蛋白屬于植物SGNH脂肪酶家族。對來自不同植物物種的GDSL同源蛋白進行序列比對分析發現，BnGLIP1在不同的物種中具有很高的保守性，特別是與雙子葉植物油菜、擬南芥、山茱萸的GDSL脂肪酶在氨基酸水平上有很高的同源性。

植物基因在各組織器官的表達情況對其功能具有很大的影響，如Kondou等研究了擬南芥的RGE1基因，該基因在種子萌發階段的胚乳中特異表達，在心形階段控制胚胎的發育中起著重要的作用[19]。筆者利用qRT-PCR比較了該基因在不同組織中的表達，結果發現該基因在不同組織中的表達差異較大，其中在角果中表達量最高，推測此基因可能在角果期發揮功能。與筆者研究結果一致，目前所報道的脂肪酶基因在不同組織器官中的表達特征呈現出多樣性，Lee等發現擬南芥GLIP2在根和莖以及早期幼苗階段（1周齡）中高表達，而GLIP1在1周齡幼苗、花、葉、莖、根等階段均有表達[20]。此外，它的表達還受到干旱、高鹽等各種環境脅迫的誘導，受到低溫、高溫等環境條件的抑制，表明BnGLIP1基因除了參與脂肪酸代謝外，也參與了對環境脅迫的響應。

生物信息學分析還發現，BnGLIP1蛋白含有1段跨膜結構域，都屬于親水性蛋白，在N端有1段含有25個氨基酸序列的信號肽，可能分泌到細胞外。TargetP 1.1 Server分析發現，SP數值為0.976，更進一步說明了它是一個分泌蛋白。在擬南芥中，其同源蛋白GDSL脂肪酶GLIP1也是一個分泌蛋白，它通過信號傳導調節激活植物局部和系統的抗性，在植物免疫反應中發揮了重要作用[21]。所以筆者推測甘藍型油菜BnGLIP1很可能也是一個植物防衛反應相關的蛋白，通過對其進行轉基因及酶活分析將有助于進一步了解BnGLIP1的生物學功能。

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