新疆農牧區擬蛹螺屬2種蝸牛形態特征和分子數據的比較研究

楊呂娟 張子俊 張衛紅

摘要：擬蛹螺屬（Pseudonapaeus）種類多為農牧業的害蟲，不僅危害各種蔬菜、花卉，其中某些種類還是家畜、家禽雙腔科吸蟲的中間宿主。本研究主要探究該屬形態相似2種蝸牛的形態解剖學和分子生物學特征，確定它們分類，為該類動物的防治和系統分類學研究提供數據基礎。形態結果顯示，2種蝸牛的生境，貝殼質地、大小和顏色，齒舌以及顎片的形態結構相似;但貝殼形狀、殼口齒數、生殖系統的解剖特征等存在顯著差異。其中，一種為鉆擬蛹螺Pseudonapaeus miser（Martens，1874），另一種為新種，即吐爾根擬蛹螺Pseudonapaeus tuegenensis sp. nov.。分子結果顯示：（1）基于COⅠ基因序列（651 bp）構建的系統發育樹中，新種和鉆擬蛹螺以高支持率（后驗概率96%）形成一個單系（支系A），顯示二者有密切的親緣關系，但是鉆擬蛹螺3個個體以高支持率（后驗概率100%）聚為一支，與新種產生分異;（2）基于ITS1基因序列（610 bp），新種與鉆擬蛹螺之間的遺傳距離為13.7%（12.5%～15.1%）（與本屬其他種間的遺傳距離更大），顯著高于種內遺傳距離2.5%（1.3%～3.5%）。結合COⅠ基因系統發育樹的結果，支持二者為不同種。分子分析的結果支持比較形態學的結果，確定吐爾根擬蛹螺P.tuegenensis sp. nov.不同于鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）為一新種，利用分子系統學方法研究該屬的分類問題在國內為首次。

關鍵詞：擬蛹螺屬;形態解剖;COⅠ基因;ITS1;新種;新疆

中圖分類號：S433.89?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0121-06

收稿日期：2018-11-17

基金項目：國家自然科學基金（編號：31260506）。

作者簡介：楊呂娟（1992—），女，四川遂寧人，碩士，主要從事貝類學研究。E-mail：YLJ687592@163.com。

通信作者：張衛紅，碩士，副教授，主要從事貝類學研究。E-mail：zwh6879a@163.com。

擬蛹螺屬（Pseudonapaeus）由Westerlund于1887年建立，隸屬于腹足綱（Gastropoda）柄眼目（Stylommatophora）艾納螺科（Enidae）。該屬的多數種類是農業和畜牧業的害蟲，常危害各種蔬菜、花卉的幼芽、嫩葉等，其中某些種類為家畜、家禽及野生動物雙腔科吸蟲的中間宿主[1-2]。陳德牛等報道雙腔吸蟲病在新疆牧區廣為流行，大大影響家畜的體膘和產毛量，甚至引起牲畜死亡，其中間宿主為某些陸生螺類（包括艾納螺科的一些種類）[3]。

擬蛹螺屬地理分布較窄，主要分布于中亞以及印度半島西北部，現記載有40余種[4]。我國對該屬的研究相對不足，到目前為止僅報道一種，即鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）。該種在國外分布于塔吉克斯坦、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、俄羅斯、土耳其等地區，在我國僅在新疆阿勒泰、木壘、庫爾勒、烏什、阿克蘇及天山一帶農田和牧區有分布[5-8]。本研究采用比較形態解剖學和分子分析的方法，對采自新疆伊犁貝殼相似的擬蛹螺屬2種蝸牛的貝殼形態，齒舌、顎片的電鏡掃描結構，生殖系統的解剖特征，線粒體基因（COⅠ）以及核基因（ITS1）的DNA序列進行詳盡的比較研究，確定它們的分類，其中一種為鉆擬蛹螺P.miser，另一種為新種吐爾根擬蛹螺P.tuegenensis sp. nov.。本研究首次應用比較形態解剖學和分子序列分析的方法探討該屬的分類問題，研究結果可以促進我國陸生貝類系統分類學的研究，也可為該類動物的防治提供數據基礎。

1?材料與方法

1.1?樣本

鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）6只標本（XJU E.13031）于2013年8月12日，采自新疆伊寧縣多浪農場3隊（81°38′E，43°46′N，海拔721 m），采集人為張衛紅;53只標本（XJU E.13003）于2015年4月17日，采自新疆新源縣鐵木里克村（83°08′E，43°33′N，海拔887 m），采集人為楊松（新種采集信息見新種描述）。標本處理參考陳德牛等的方法[9]，保存于無水乙醇中。Orculidae科與艾納螺科（Enidae）親緣關系較近[10]，故在NCBI數據庫中選取Orculidae科2個種：Schileykula trapezensis（Stojaspal，1981）、Sphyradium doliolum（Bruguiere，1792）的COⅠ基因序列作為外群用于系統發育關系分析，并選取數據庫中擬蛹螺屬所有種類的ITS1基因共4條序列以及艾納螺科相關種類COⅠ基因共7條序列用于參考分析（NCBI數據庫中僅有擬蛹螺屬部分種類ITS1的基因序列，沒有該屬種類COⅠ基因的序列）（表1）。

1.2?形態測量與比較

用游標卡尺（錫工牌0～150 mm）對2種各14只成體螺進行了測量。螺層數的計算采用Kerney等描述的方法[11]。貝殼照片用Nikon SMZ25數碼體式顯微鏡拍攝。在Olympus SZ2-ILST解剖鏡下對2種各3只成體螺進行軟體解剖[12]及齒舌、顎片電鏡樣品制備[13-14]。生殖系統解剖圖參考iphone手機拍攝的照片手繪完成。齒舌、顎片用LEO143OVT電子掃描顯微鏡掃描拍照。標本保存于新疆大學生命科學與技術學院。

1.3?分子分析

每種各3只標本，分別取腹足肌肉約30 mg，采用血液/細胞/組織基因組提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取基因組DNA。線粒體COⅠ基因PCR擴增引物參照文獻[15]：LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′），HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）;核基因內部轉錄間隔區ITS1基因PCR擴增引物參照文獻[16]：ITS1L（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGAT-3′），58C（5′-TGCGTTCAAGATATCGATGTTCAA-3′），引物由北京華大基因公司合成。PCR反應體系為20.0 μL，其中包括2×Taq PCR Master Mix10.0 μL、7.0 μL ddH2O、正反向引物各0.5 μL、DNA模板2.0 μL。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性1 min;94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，運行35個循環;72 ℃延伸10 min。通過MEGA 5.0進行序列比對和編輯[17]，基于Kimura-2-parameter（K2P）模型進行遺傳距離分析，采用鄰接法（NJ）構建分子系統樹，利用Sequin軟件將序列上傳至NCBI數據庫中。

2?結果與分析

2.1?鉆擬蛹螺Pseudonapaeus miser（Martens，1874）（圖1，圖2-a）

Buliminus miser Martens，1874：21-22，fig.17.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）Schileyko，1952：204，fig.117.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）陳德牛，1987：56，fig.67.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）Sysoev，2009：68-69，fig.29I.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）錢周興，2013：56.

2.1.1?形態特征

貝殼：貝殼小型，殼質厚，堅實，不透明，呈蛹形。有5.1～6.0個螺層。殼高7.78～10.92 mm[（9.26±0.36） mm]，殼寬3.34～4.72 mm[（4.10±0.36） mm]，殼口高2.76～4.12 mm[（3.47±0.31） mm]，殼口寬2.14～3.34 mm[（2.74±0.32） mm]。殼面黃棕色或淺黃棕色、光滑、有光澤，具有不均勻分布的稀疏生長線和螺紋特點，殼頂鈍、縫合線深，殼口呈橢圓形、口緣外折、臍孔狹小，呈縫隙狀。殼口具3齒，為軸唇齒、腔壁齒、腭壁齒（圖1-A至圖1-E）。

齒舌：角質，長帶狀，其上具100～102行齒，齒式為（12～13） ∶（10～11） ∶1 ∶（10～11） ∶（12～13）。中央齒三錐型、主錐尖、呈菱形，明顯長于基板（圖1-F）。側齒雙錐型，主錐和外錐均比中央齒的大（圖1-G）。緣齒雙錐型，靠近外側的緣齒外錐常分裂為2～4枚小齒（圖1-H）。顎片小、幾丁質、半月形、棕色，具明顯的縱行肋紋（圖1-I）。

生殖系統：陰莖圓柱狀，較長，陰莖基背板中等長度，鞭狀器退化幾乎闕如，具盲突、陰莖附屬器官各部分（A-1+A-2、A-3、A-4、A-5）均有發育。陰道短，陰道與游離輸卵管長度比為1 ∶3。受精囊管長，受精囊無柄，少數質地較薄，受精囊管分支盲囊不膨大（圖2-A）。

棲息環境：鉆擬蛹螺生活在山區、丘陵地帶灌木叢以及農田附近潮濕的草叢中，石塊或落葉下，有時也躲在石縫里。本研究的標本采自海拔為700～900 m天然草場的草叢中。

2.1.2?分類學比較

本研究的標本貝殼形態及大小與文獻中對鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）的描述[4-7，18]總體一致。但陳德牛等[5]和錢周興等[7]描述的該種標本貝殼呈角褐色，與本研究的標本略有差異;錢周興等描述的標本殼口具2枚齒[7]，與本研究的標本存在差異。本研究的標本貝殼形態與部分文獻中的描述略有差異，但是與模式標本的描述總體一致，并且陸生貝類同種不同種群、不同個體間貝殼形態會存在一定的變化[19]，綜合分析本研究的標本為鉆擬蛹螺。

2.2?吐爾根擬蛹螺

新種Pseudonapaeus tuergenensis sp.nov.（圖2-B、圖3），正模標本：殼高9.42 mm，殼寬4.48 mm，殼口高3.52 mm，殼口寬3.38 mm。2015年4月21日采自新疆伊犁新源縣吐爾根農場（83°20′E，43°32′N，海拔911 m），1只（XJU E.13001），采集人楊松。

副模標本：殼高9.42～11.12 mm[（10.14±0.62） mm]，殼寬4.48～5.9 mm[（5.10±0.40） mm]，殼口高3.52～4.60 mm[（4.06±0.30） mm]，殼口寬3.38～4.00 mm[（3.70±0.23） mm]，43只（XJU E.13002），采集信息同正模。

2.2.1?形態特征

貝殼：貝殼小型、殼質厚、堅實、不透明、呈塔形。有6.1～7.0個螺層，倒數第一、二螺層呈不均勻的灰白色或黃灰色，其余螺層呈淺棕色。殼面有光澤，具不均勻分布的稀疏生長線和螺紋;殼頂鈍;縫合線深;殼口呈橢圓形，口緣向外擴大。臍孔狹小，呈縫隙狀（圖3-A至圖3-D）。

齒舌：角質，長帶狀，其上具90～92行齒，齒式為（12～13） ∶（9～10） ∶1 ∶（9～10） ∶（12～13）。中央齒三錐型，主錐尖、呈菱形、略長于基板（圖3-E）。側齒雙錐型，主錐和外錐均比中央齒的大（圖3-F）。緣齒雙錐型，靠近外側的緣齒外錐常分裂為2～4枚小齒（圖3-G）。顎片：小，幾丁質，半月形，棕色，具縱行肋紋（圖3-H）。

生殖系統：陰莖圓柱狀，較短，陰莖基背板中等長度，鞭狀器退化幾乎闕如，具盲突。陰莖附屬器官（A-1+A-2、A-3、A-4、A-5）均有發育。陰道長，陰道與游離輸卵管長度比為1 ∶1.6。受精囊管中等長度，受精囊中等大小，橢球形，受精囊管無分支盲囊（圖2-B）。

2.2.2?分類學比較

吐爾根擬蛹螺P.tuergenensis sp. nov.與新種鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）均分布于新疆伊犁，它們的生境，貝殼質地、大小和顏色及齒舌和顎片的形態結構相似。但鉆擬蛹螺貝殼較小，呈蛹形，殼口具3枚齒，陰莖較長，陰道較短，受精囊管有分支盲囊。新種貝殼較大，呈塔形，殼口無齒，陰莖較短，陰道較長，受精囊管無分支盲囊，與前者差異明顯[4，6-7]。

P.submucronatus（Lindholm，1927）分布于吉爾吉斯斯坦天山山脈，其貝殼呈塔形、殼口無齒，形態與新種相似。但P.submucronatus貝殼較大（殼高13～17 mm，殼寬7～9 mm），陰莖較長，鞭狀器明顯，陰道長（陰道與游離輸卵管長度比為3 ∶1），受精囊管有分支盲囊，與新種差異明顯[18]。由于缺少P.submucronatus的分子系統學數據，對于2種的比較有待進一步研究。

2.3?分子系統學分析

共測得10條基因序列，其中ITS1基因序列6條（鉆擬蛹螺、吐爾根擬蛹螺各3條），有效長度為610 bp;COⅠ基因序列4條（鉆擬蛹螺3條、吐爾根擬蛹螺1條），有效長度為651 bp，其中3條鉆擬蛹螺COⅠ基因共享一個單倍型。8條序列上傳至GenBank（MK131271～MK131276、MK138523～MK138524）。

基于COⅠ基因序列構建的系統發育樹結果（圖4）顯示，新種和鉆擬蛹螺以高支持率（后驗概率96%）與其他各屬種分開，形成一個單系（支系A），顯示二者有密切的親緣關系;但鉆擬蛹螺3個個體以高支持率（后驗概率100%）聚為一支，與新種產生分異。基于ITS1基因序列遺傳距離的結果（表2）顯示，新種與鉆擬蛹螺之間的遺傳距離為13.7%（12.5%～15.1%），顯著高于種內遺傳距離（吐爾根擬蛹螺種內遺傳距離為2.5%（1.3%～3.5%），鉆擬蛹螺的種內遺傳距離為1.4%（1.2%～1.5%）且無重疊，顯示二者之間的遺傳分異已達到種的水平，為不同種。結合比較形態學的結果，進一步確定吐爾根擬蛹螺為一新種。

3?結論與討論

Martens 1874年建立P.miser時將其歸為Buliminus屬，后Schileyko（1952，1998）基于生殖系統的特征將其移入Pseudonapaeus屬（Pseudonapaeus屬鞭狀器退化幾乎闕如、陰莖基背板具盲突、陰莖末端無膨大現象;而Buliminus屬鞭狀器長、陰莖基背板無盲突、陰莖末端膨大）。依據線粒體COⅠ基因序列構建的艾納螺科7屬9種間的系統發育樹顯示，本研究中P.miser和新種以高支持率（后驗概率96%）形成支系A，與Buliminus屬2種形成的分支明顯分開，該結果支持P.miser不應隸屬于Buliminus屬。鉆擬蛹螺在我國僅分布于新疆，該種的內部解剖結構和分子序列過去未見報道?本研究

首次對鉆擬蛹螺生殖系統以及齒舌、顎片的形態結構進行了描述并對其線粒體基因（COⅠ）和核基因（ITS1）的DNA序列進行了報道，為該種的準確鑒定提供了更詳盡的數據依據。

擬蛹螺屬目前在我國僅有本研究報道的2種。該屬分子數據貧乏，NCBI數據庫中僅有該屬4種4條ITS1基因序列數據，關于這2個種的系統發育位置有待后續研究。由于我國對該屬缺乏系統的研究，該類群對新疆農牧區的危害情況尚屬未知。本研究結果為進一步研究該類群的分類學、生物學、生態學和害蟲防治提供了數據基礎。

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