嘔吐毒素對小鼠T淋巴細胞體外活化及相應活化標志分子的影響

劉雙雙 孫凱 蔡國棟 宋瑞龍 鄒輝 顧建紅 袁燕 劉學忠 劉宗平 卞建春

摘要：為探究脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，簡稱DON）對離體T淋巴細胞活化的抑制作用，研究DON對刀豆蛋白A（concanavalin A，簡稱Con A）介導的小鼠離體T淋巴細胞活化及活化標志分子CD69、CD25、CD71的影響，以BALB/c小鼠T淋巴細胞為材料，分設細胞空白組、刀豆蛋白A對照組、不同濃度DON染毒組（Con A+0.5/1/2 μmol/L DON），用CCK-8法檢測24h內細胞的相對活性，用流式細胞術分別檢測6、30、72 h時CD69、CD25、CD71的表達量。結果顯示，DON在終濃度為0.5、1、2 μmol/L時均極顯著地降低了Con A介導的T細胞的相對活性（P<0.01），在終濃度為2 μmol/L時顯著地降低了T細胞CD69的表達率（P<0.05），在終濃度為0.5、1、2 μmol/L時均極顯著地降低了CD25、CD71的表達率（P<0.01），且呈劑量效應關系。由結果可知，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對動物機體免疫抑制作用的產生與其直接抑制小鼠T淋巴細胞的活化有關。

關鍵詞：嘔吐毒素;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;刀豆蛋白;T淋巴細胞;CD69;CD25;CD71

中圖分類號： S852.4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0150-06

收稿日期：2019-01-15

基金項目：國家重點研發計劃支持項目（編號：2016YFD0501208）;江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（PAPD）。

作者簡介：劉雙雙（1996—），女，河南漯河人，碩士，主要從事動物營養代謝病與中毒病研究。E-mail：1326247070@qq.com。

通信作者：卞建春，博士，教授，主要從事動物營養代謝病與中毒病研究。Tel：（0514）87979042;E-mail：jcbian@yzu.edu.cn。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，簡稱DON）又名嘔吐毒素（vomitoxin，簡稱VT）[1-2]，是一種由粉紅鐮刀菌和禾谷鐮刀菌產生的單端孢霉烯族毒素，是廣泛引起糧食、飼料污染的主要霉菌毒素之一。1970年日本諸罔信一等首次從香川縣感染赤霉病的大麥中分離到DON。DON的細胞毒性很強，但無特殊的靶器官，對機體各種器官均有影響。不同動物對DON的敏感程度表現不一，豬最敏感[3]。近年來，在我國動物配合飼料中DON的檢出率高達98.02%，在豬飼料中最高含量達到4 773 μg/kg，遠遠超出我國限量標準（1 000 μg/kg），引起了養殖業的廣泛重視[4-5]。目前，國內外對DON毒性的研究主要集中在動物生產性能、器官組織病理損傷、免疫功能等方面[6]。大量研究證明，DON可對動物機體的免疫系統產生明顯的急、慢性毒性作用。據報道，一次急性染毒DON可以導致小鼠肝、腎、脾、胸腺的細胞損傷，誘導和促進免疫細胞的凋亡并抑制其增殖[7-8]。T淋巴細胞在細胞免疫中發揮主要作用，而其發揮作用的重要前提和基礎是T細胞必須經過活化及增殖[9-10]。目前的研究表明，DON在體內外均可抑制T淋巴細胞的活化與增殖[7，11]，但其作用機制尚未闡明。為了揭示DON抑制T淋巴細胞的活性與活化作用的機制，本研究分析了DON對離體T淋巴細胞活化過程的影響，并研究了DON對T細胞早期活化抗原CD69、中期活化抗原CD25和CD71表達的影響，本研究結果可以為DON中毒的防控提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗動物?清潔級BALB/c小鼠，雄性，4～5周齡，體質量（20±2） g，購自揚州大學實驗動物中心。

1.1.2?主要試劑與儀器?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、刀豆蛋白（concanavalin A，簡稱Con A），購自美國Sigma公司;CD3-APC、CD69-FITC、CD4-FITC、CD25-PE、CD71-PE流式抗體，購自美國BD公司;RPMI-1640完全培養液，含10%胎牛血清（Gibco）、L-谷氨酰胺（2 mmol/L，Sigma）、二巰基乙醇（50 μmol/L，Sigma）、1%青鏈霉素（青霉素、鏈霉素比例為1 ∶1）、RPMI-1640培養基粉末（Gibco）;Cell Counting Kit-8，東仁化學科技有限公司;紅細胞裂解液，購自索萊寶生物科技有限公司。

CyAn ADP7流式細胞儀，美國Beckman Couiter公司生產;CO2培養箱，美國Thermo生產;Tecan Sunrise光吸收酶標儀，澳大利亞Tecan公司生產;SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司生產;5810R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司生產。

1.2?試驗方法

1.2.1?脾臟淋巴細胞懸液的制備?將BALB/c小鼠斷頸處死，無菌摘取脾臟，用組織研磨棒在200目濾網上研磨過濾，制備單細胞懸液。加入紅細胞裂解液處理3 min后，用無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細胞2次，1 000 r/min離心8 min。

將細胞按一定比例稀釋后重懸于1 mL 10%胎牛血清RPMI-1640完全培養液中，用臺盼藍染色計數活細胞數（活細胞數占總細胞數的95%以上），最終調整為細胞密度為3×106 mL的淋巴細胞懸液。

1.2.2?CCK-8法檢測DON對小鼠T淋巴細胞體外存活的影響?本試驗分別設細胞空白組（Control組）、Con A對照組（終質量濃度為5 mg/L，參照筆者所在實驗室前期的研究成果[12]，下同）、Con A+0.5 μmol/L DON（終質量濃度，下同）組、Con A+1 μmol/L DON組、Con A+2 μmol/L DON組，將制得的淋巴細胞懸液接種于12孔板中，每孔1 mL，于藥物處理組中加入相應濃度的DON工作液各2 μL（終質量濃度與各處理組對應），除細胞空白組外，每組加入5 μL Con A（終濃度為5 mg/L）。混勻每孔中的培養液，分組加入96孔板中，每組設6個重復，100 μL/孔，同時設立空白對照孔（不加細胞），之后在37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養24 h。加入CCK-8試劑，10 μL/孔，于37 ℃、CO2培養箱中培養3 h后，立刻用酶標儀在450 nm處測定吸光度。根據公式[細胞相對存活率=（處理組吸光度-空白對照組吸光度）/（Con A組吸光度-空白對照組吸光度）]計算細胞相對存活率。具體公式如下：

細胞存活率=[（D450 nm（s）-D450 nm（b））/（D450 nm（c）-D450 nm（b））]×100%;

抑制率=[（D450 nm（c）-D450 nm（s））/（D450 nm（c）-D450 nm（b））]×100%。

式中：s表示試驗孔;c表示對照孔;b表示空白孔。

1.2.3?T細胞CD69、CD25、CD71表達的檢測?采用直接免疫熒光標記法染色，細胞培養6 h后，取樣離心，用冷PBS清洗2次后，將細胞懸液濃縮至100 μL，分別加入1 μg CD3-APC、CD69-FITC單克隆抗體;細胞培養30 h后，分別加入1 μg CD25-PE、CD4-FITC單克隆抗體;細胞培養72 h后，分別加入1 μg CD71-PE、CD3-APC單克隆抗體，4 ℃避光孵育30 min，用冷PBS離心洗滌1次，重懸于500 μL PBS中，立即上流式細胞儀（FACSCalibur）檢測。

1.2.4?統計學分析?所有數據以均值±標準差表示，用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，組間比較采用配對t檢驗，以P<0.05、P<0.01作為差異顯著性判斷標準。

2?結果與分析

2.1?DON對小鼠T淋巴細胞相對活性的影響

小鼠T淋巴細胞培養24 h后，用酶標儀在450 nm 處測定吸光度，以此來計算細胞的相對活性。由圖1可見，加入Con A后，與細胞空白組對比，細胞的相對活性極顯著提高（P<0.01）;加入DON后，各染毒組細胞活性均降低，與Con A比較均存在極顯著差異（P<0.01）。

2.2?DON對小鼠T淋巴細胞CD69表達的影響

小鼠T淋巴細胞培養6 h后，用流式細胞術檢測T淋巴細胞早期活化抗原CD69的表達情況。如圖2所示，細胞空白組小鼠CD3+T細胞中CD69+T細胞的比例為（9.04±6.24）%，即CD69的表達率為（9.04±6.24）%。在用Con A刺激6 h后，其CD69表達量達到（35.88±7.20）%，與空白組相比極顯著升高（P<0.01）。加入DON后，隨著DON終濃度的升高，Con A介導的T細胞CD69表達呈現下降趨勢，并具有劑量-效應關系，2 μmol/L DON組與Con A組相比差異顯著（P<0.05）。

2.3?DON對小鼠T淋巴細胞CD25表達的影響

小鼠T淋巴細胞培養30 h后，用流式細胞術檢測調節T淋巴細胞中期活化抗原CD25的表達。由圖3可以看出，細胞空白組小鼠CD4+T細胞中CD25+T細胞的比例為（9.88±2.57）%，即CD25的表達率為（9.88±2.57）%。在用Con A刺激30 h 后，其CD25表達量達到（50.64±6.54）%，與空白組相比極顯著升高（P<0.01）。加入DON后，隨著DON終濃度的升高，Con A介導的T細胞CD25表達呈現下降趨勢，并具有劑量-效應關系，各染毒組與Con A組相比均有極顯著差異（P<0.01）。

2.4?DON對小鼠T淋巴細胞CD71表達的影響

小鼠T淋巴細胞培養72 h后，用雙抗體染色法結合流式細胞術檢測調節T淋巴細胞中期活化抗原CD71的表達。由圖4可以看出，細胞空白組小鼠CD3+T細胞中CD71+T細胞的比例為（2.88±2.57）%，即CD71表達率為（2.88±2.57）%。在用Con A刺激72 h后，其CD71表達量達到（35.81±6.54）%，與空白組相比極顯著升高（P<0.01）。加入DON后，隨著DON終濃度的升高?Con A介導的

T細胞CD71的表達量呈現下降趨勢，并具有劑量-效應關系，各染毒組與Con A組相比均有極顯著差異（P<0.01）。

3?討論

DON對谷物的污染狀況相當普遍，其對動物機體免疫功能的影響已經引起醫學界的廣泛重視。DON在高濃度時可誘導免疫細胞凋亡，從而引發免疫抑制;在低濃度時可抑制免疫細胞增殖和細胞因子的分泌，擾亂免疫系統的正常功能[13]。DON也可通過對淋巴結和脾臟中免疫細胞數量和功能的調節，引起小鼠淋巴細胞免疫球蛋白A（IgA）分泌量升高[14]。Kim等報道，DON可導致雄性小鼠體內IgM、IgG的含量明顯降低[15]。Ouyang等研究發現，DON能延遲或抑制體外培養CD4+T淋巴細胞的增殖[11]。總之，DON可以通過誘導免疫細胞凋亡、抑制其增殖而影響免疫細胞因子的分泌及抗體的表達，進而對細胞免疫和體液免疫產生影響。淋巴細胞是動物機體進行免疫調節的核心成分，其中T淋巴細胞是淋巴細胞中數量最多、功能最復雜的一類。它具有多種生物學功能，如直接殺傷靶細胞、輔助或抑制B細胞產生抗體、對特異性抗原或促有絲分裂原的應答反應以及產生細胞因子等，此外，T淋巴細胞對機體抵御疾病也發揮著非常重要的作用[16]。目前，在關于DON免疫毒性機制的相關研究中，雖已有報道表明，DON可以抑制T淋巴細胞的增殖，但其作用機制尚不明確。T淋巴細胞的活化是其發揮免疫功能的重要前提和基礎[9]。本試

驗在證明了DON對小鼠活化過程中的T淋巴細胞相對有明顯的抑制作用的基礎上，進一步探究了DON對T細胞活化抗原表達的影響。

Con A是T細胞多克隆刺激劑，可以作用于T細胞表面的T細胞抗原受體（TCR）-CD3復合體，從而刺激T細胞活化及增殖反應[17]。T細胞活化后可誘發靜止細胞分泌淋巴因子IL-4、γ-IFN等，同時表達一系列新的表面分子（如高親和力CD69和CD25）等[18-20]，這些分子被稱為表面活化標志。CD69是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，是活化的T細胞表面最早表達的分子。靜止狀態下的T細胞一般不表達CD69，在活化后1～2 h即可以檢測到CD69的表達[21]，它可以作為細胞共刺激信號進一步增強細胞的活化或增殖分化，可介導細胞激活后細胞因子的合成[22]，因此CD69可作為T細胞早期活化的標志。本研究發現，DON可抑制Con A介導的T淋巴細胞CD69的表達，說明DON可通過抑制CD69的表達來降低細胞前期活化的效應。CD25是IL-2（白介素2）受體的α鏈，分子量為55 ku，主要在CD4+T細胞上表達[23]。IL-2受體能否表達主要取決于T細胞對IL-2的應答，極少部分靜止的T細胞會表達IL-2受體，而活化的T細胞表達量明顯上升，因為T細胞通過抗原提呈細胞（APC）遞呈的抗原產生活性后，能使T細胞膜表面表達CD25即IL-2R，并分泌產生大量IL-2。因此可見，CD25可反映活化T細胞的增殖，被認為是激活T淋巴細胞的標志[24]。本研究發現，DON可抑制Con A介導的T淋巴細胞CD25的表達，并可能因此抑制T細胞對IL-2的應答，從而影響免疫功能。CD71是轉鐵蛋白受體（TfR），表達于活化的白細胞，分子量約為95 ku，是細胞生長和吸收鐵所必需的蛋白。TfR是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，是由2個同源二聚體（180 ku）的亞基通過2條二硫鍵交聯而成的。TfR的表達量主要是根據細胞內的鐵水平進行轉錄調節的[25]，所有正常細胞都能低水平表達CD71，但處于高增殖狀態的細胞表達水平會明顯升高。CD71不僅僅參與鐵的吸收，在細胞的生長、增殖中發揮作用，同時具有免疫調節功能，可以提供激活T細胞所必需的第二刺激信號，這也表明CD71是正常T細胞成熟所必需的。本研究發現，DON可以抑制Con A介導的T淋巴細胞CD71的表達，影響了細胞的生長、增殖和免疫調節功能的發揮。本研究還發現，DON可通過抑制T淋巴細胞的活化及表面活化標志分子的表達，影響動物機體細胞免疫的調節功能，從而引起免疫抑制的發生。

4?結論

DON可直接抑制Con A介導的小鼠T淋巴細胞體外活化，并且能夠抑制早期活化標志CD69及中期活化標志CD25、CD71的表達。這一結果表明DON對動物免疫系統的抑制作用與其可直接抑制T淋巴細胞的活性與活化作用有關。

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