氟蟲腈在中華絨螯蟹中的殘留效應

陳曦 張聰 宋超 方龍香 董欣悅 陳家長

摘要：采用半靜態實驗法，設置質量濃度為10、30、50 μg/L的氟蟲腈水溶液在中華絨螯蟹中的殘留效應試驗。結果表明，不同質量濃度的處理組分析，高質量濃度組中華絨螯蟹蟹腿中氟蟲腈的含量顯著高于低質量濃度組，高質量濃度組中華絨螯蟹身體中的含量也顯著高于低質量濃度組。對中華絨螯蟹不同部位氟蟲腈的含量分析無差異性，氟蟲腈富集部位的走向應該是先從腿部再到身體最后到性腺。氟蟲腈在中華絨螯蟹體內的殘留沒有性別選擇性，但雌性中華絨螯蟹體內富集的速度比雄性的快。此次研究可為處理相關的漁業污染事故提供一定的參考。

關鍵詞：氟蟲腈;中華絨螯蟹;殘留效應

中圖分類號： X592;X714文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0176-05

收稿日期：2018-11-30

基金項目：中國水產科學研究院基本科研業務費（編號：2018HY-ZD0605）;國家水產品質量安全風險評估項目（編號：GJFP2018009）。

作者簡介：陳?曦（1992—），女，安徽無為人，碩士，研究實習員，主要從事漁業生態環境修復方面的研究。E-mail：chenx@ffrc.cn。

通信作者：陳家長，碩士，研究員，主要從事漁業環境監測與保護，水產品質量安全與風險評估方面的研究。E-mail：chenjz@ffrc.cn。

2018年6月，德國發現受氟蟲腈污染的荷蘭“毒雞蛋”流入超市，食品安全問題引發了人們的關注。氟蟲腈是一種廣譜類殺蟲劑，對害蟲以胃毒作用為主，并有觸殺和內吸作用，用于殺滅蚜蟲、鱗翅目幼蟲、蠅類和鞘翅目等害蟲[1-3]。按照我國農藥急性毒性分級標準，氟蟲腈屬于中等毒性藥物[4]。由于氟蟲腈對甲殼類水生生物和蜜蜂具有高風險，并且其在水和土壤中降解慢，我國在《中華人民共和國農業部公告第1157號》文件中規定，自2009年10月1日起，除衛生用、玉米等部分旱田種子包衣劑外，在我國境內停止銷售和使用含氟蟲腈成分的農藥制劑[5]。

中華絨螯蟹肉味鮮美、營養豐富、經濟價值較高，深受廣大消費者喜愛。玉米是中華絨螯蟹的主要飼料成分之一，含氟蟲腈成分包衣劑的使用可能會引入到中華絨螯蟹的生長環境中。研究表明，氟蟲腈對甲殼類動物有劇毒[6];王志錚等研究發現，氟蟲腈對中華鱉稚鱉96 h半致死質量濃度為0.28 mg/L[7];單正軍等通過稻田-魚塘模擬試驗表明，氟蟲腈對中華絨螯蟹（體質量1 g）96 h的LC50為0.008 6 mg/L[8]。目前，氟蟲腈在中華絨螯蟹中的殘留含量研究較少，同時，考察氟蟲腈對中華絨螯蟹不同部位、不同性別的殘留區別研究亦未見報道。為此，本研究通過采用室內模擬試驗，研究氟蟲腈在中華絨螯蟹中的殘留含量，以期為中華絨螯蟹食用安全性及相關漁業污染事故處理提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?受試生物

試驗種類為中華絨螯蟹成蟹（最后一次蛻殼之前），購自江蘇省江陰市某中華絨螯蟹養殖場，大小一致，體質量為（91.79±12.21） g，先在室內飼養1周，以適應環境，選擇健康有活力的用于試驗。

1.1.2?試驗用水

在室外曝氣3 d以上的自來水，水溫20～24 ℃。

1.1.3?儀器與試劑

GL-22MS高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）;sartorius離心機（Sigma）;Acquity UPLC I-Class，Xevo TQD液質聯用儀（Waters）。Agilent Bond Elut EMR-Lipid增強型脂質去除凈化管;Agilent Bond Elut EMR-Lipid Polish反萃管。甲醇、甲酸、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純，水為超純水，氟蟲腈標準溶液。

1.2?試驗方法

1.2.1?氟蟲腈暴露處理

采用半靜態試驗法，室內溫度設為23 ℃。將供試中華絨螯蟹放入玻璃缸內（長39.5 cm×寬28.5 cm×深29.5 cm），在缸內分別裝入6 L不同濃度的稀釋液，用增氧泵進行增氧，每個缸內放入5只中華絨螯蟹，共設6個處理和2個空白對照，每個處理3個重復。試驗期間不喂食，每隔48 h更換1次藥液，試驗周期為4周，每隔1周采樣1次。

根據課題組預試驗以確定本次試驗藥物質量濃度，既可以測出中毒中華絨螯蟹體內氟蟲腈的殘留又要保持在試驗結束時中華絨螯蟹不至于全部死亡。處理組的質量濃度分別為10、30、50 μg/L，每個質量濃度分性別作2個處理。

1.2.2?前處理方法

采樣時，每個缸隨機采集1只中華絨螯蟹，分別提取身體（B）、性腺（G）、蟹腿（L）的可食部分進行檢測。稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL提取液（乙酸乙酯、乙腈和甲酸，其體積比為99.5 ∶99.5 ∶1.0），2 000 r/min渦旋振蕩15 min，12 000 r/min離心5 min;取5 mL離心后的上清液加入至已用5 mL水活化好的Agilent Bond Elut EMR-Lipid增強型脂質去除凈化管中，2 000 r/min 渦旋振蕩5 min，4 000 r/min離心5 min;將離心后的上清液全部轉入含1.7 g EMR-Lipid Polish MgSO4的離心管中，2 000 r/min渦旋振蕩5 min，4 000 r/min離心5 min，取有機相（上層）過0.22 μm有機相濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.2.3?儀器分析條件

質譜條件：離子采集模式為ES-;毛細管電壓：2.6 kV;錐孔電壓：36 V;離子源溫度150 ℃;脫溶劑氣溫度350 ℃;脫溶劑氣流速650 L/h;錐孔氣流速30 L/h;MRM監測模式下氟蟲腈的母離子質荷（m/z）比為434.844，定量離子質荷比（m/z）為317.930;保留時間為2.13 min。

色譜條件：色譜柱：Acquity UPLC BEH C181.7 μm，2.1×100 mm column;柱溫：30 ℃;自動進樣器溫度設為10 ℃;進樣量5 μL。

梯度洗脫程序見表1。

2?結果與討論

2.1?中華絨螯蟹中毒癥狀

試驗初始，受試中華絨螯蟹放入藥液中比較興奮，四處亂竄，之后靜伏于容器底部，在玻璃缸中正常生存與對照組無明顯差別。所設置的3個處理組在96 h內，中華絨螯蟹無明顯中毒癥狀，有個別中華絨螯蟹死亡，后高質量濃度組中華絨螯蟹出現8足支起呈穹形，發生抱團群聚行為，中華絨螯蟹之間互相打架，用螯足將對方的步足不斷鉗掉，6 d后高質量濃度組的中華絨螯蟹陸續吐黃水繼而死亡。隨著試驗時間延長，各試驗梯度有不同個數的死亡個體，中華絨螯蟹的中毒表現為，抱團群聚、反應遲鈍、口吐白沫。在解剖過程中，可以發現中毒的中華絨螯蟹肢體軟塌沒有彈性，背甲與胸腹的黏合不強。

氟蟲腈屬于苯基吡唑類化合物，它的作用機制

是能夠阻斷γ-氨基丁酸介導的氯離子通道的開放，從而造成中樞神經系統的過度興奮[9]。王志錚等研究發現，氟蟲腈對中華鱉稚鱉的急性毒性試驗中，中華鱉稚鱉中毒的神經癥狀與本次試驗的中華絨螯蟹神經癥狀類似，該研究認為氟蟲腈導致神經傳導、呼吸受阻以及代謝活動紊亂共同引發的中毒行為[7]。氟蟲腈急性中毒的小鼠神經元細胞出現神經膠質細胞空泡化、細胞核膜間隙輕度擴張等病理特征[10]。Carla M. Stehr等探索了氟蟲腈對斑馬魚胚胎和幼魚的影響，發現氟蟲腈可通過抑制甘氨酸受體亞型的功能從而損害魚的脊髓運動。中華絨螯蟹的背部拱起、抱團行為等神經中毒癥狀可能也與甘氨酸受體的損害有關[11]。乙酰膽堿酯酶可以保證神經沖動在突觸間的正常傳導，嚴海娟等研究發現氟蟲腈對錦鯽腦組織乙酰膽堿酯酶的抑制率可達35.21%，中華絨螯蟹神經癥狀的表現與氟蟲腈對乙酰膽堿酯酶的抑制有關[12]。

2.2?同一時間同一部位不同質量濃度處理中華絨螯蟹體內氟蟲腈的含量

由表2可知，隨時間變化，不同處理組的中華絨螯蟹體內氟蟲腈的含量，其中，空白組的中華絨螯蟹蟹腿中有氟蟲腈檢出，含量為1.3 ng/g左右。同一時間，高質量濃度組中華絨螯蟹中氟蟲腈的殘留高于中質量濃度組高于低質量濃度組（圖2）。經數據分析發現，高質量濃度組中華絨螯蟹蟹腿中氟蟲腈的含量顯著高于低質量濃度組（P<0.05），高質量濃度組中華絨螯蟹身體中的含量也顯著高于低質量濃度組（P<0.05）。性腺中氟蟲腈的殘留沒有較大差異，第1次采樣時高質量濃度組的中華絨螯蟹性腺中含量相差較大，分布不均，這可能是高質量濃度的情況下，性腺對氟蟲腈的吸附能力不同或是性腺中氟蟲腈的積累與個體差異相關。

2.3?相同時間同質量濃度處理中華絨螯蟹不同部位氟蟲腈的含量

經JMP軟件分析，中華絨螯蟹不同部位氟蟲腈的含量無差異性。但相同暴露時間相同質量濃度下，腿部的殘留量相對較低。有報道稱，氟蟲腈在脂肪組織中含量較高[8]，腿部組織中脂肪含量少，因此氟蟲腈在腿部富集相對偏少。在試驗過程中，處理組均發生斷腿的現象，分析可能是骨眼部位受氟蟲腈的影響被破壞，再者氟蟲腈對中華絨螯蟹神經系統的損害，致使中華絨螯蟹個體間互相殘殺。

在7 d時，低質量濃度組的性腺中未檢測到氟蟲腈殘留，在空白組中只有腿部檢測到氟蟲腈的含量，應該是氟蟲腈的富集先從腿部再到身體最后到性腺，這可能與中華絨螯蟹受到外部甲殼的保護有關。

2.4?同時間相同質量濃度處理不同性別中華絨螯蟹氟蟲腈的含量

由圖3可知，在7 d時，低質量濃度處理組雌性、雄性中華絨螯蟹體內氟蟲腈含量差異不大，檢測均值在2 ng/g左右;中質量濃度和高質量濃度處理組均是雌性體內的氟蟲腈含量顯著高于雄性體內，雌性體內的含量是雄性體內的2倍。在14、21 d，高質量濃度組只有雄性個體存活，低質量濃度組雄性體內的氟蟲腈含量高于雌性體內的。相對來說，隨時間變化，雌性中華絨螯蟹體內氟蟲腈富集的速度比雄性快。雖然試驗最后高質量濃度組只剩雄性中華絨螯蟹存活，但其體內氟蟲腈的含量與其他組無顯著差異，不能說明雄性中華絨螯蟹的耐受性強。據報道，雄性河口底棲橈足類對氟蟲腈比較敏感，能夠擾亂雄性性腺發育過程中非常重要的神經激素級聯，從而損害其生殖功能使后代數量減少[13]。氟蟲腈對雌、雄性大鼠的內分泌均有干擾，可使雄性大鼠甲狀腺激素下降[4]，也會影響雌性大鼠血漿孕酮、雌二醇水平[14]。可見，氟蟲腈對雌雄性動物的激素均有一定的損害作用，但氟蟲腈在中華絨螯蟹體內的殘留沒有性別選擇性。在相同質量濃度下，氟蟲腈在雌性中華絨螯蟹體內富集的速度比雄性快，并且氟蟲腈對中華絨螯蟹的生殖功能有一定的損害作用。

3?結論

氟蟲腈在中華絨螯蟹中的殘留效應為：同一時間，高質量濃度組中華絨螯蟹中氟蟲腈的殘留高于中質量濃度組高于低質量濃度組。中華絨螯蟹不同部位氟蟲腈的含量無差異性，氟蟲腈富集部位的走向應該是先從腿部再到身體最后到性腺。氟蟲腈在中華絨螯蟹體內的殘留無性別選擇性，但雌性中華絨螯蟹體內富集的速度比雄性的快。

氟蟲腈是一種對中華絨螯蟹有高風險的藥物，10 μg/L的水體質量濃度不會導致中華絨螯蟹的死亡，但隨時間的延長可以使中華絨螯蟹出現一系列的中毒癥狀。極低質量濃度的氟蟲腈在中華絨螯蟹體內檢測不出來，但其已經危害了中華絨螯蟹的生理系統，對養殖池塘的水體及附近環境中的氟蟲腈仍應加強監管。

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