1株氟環唑降解菌的分離鑒定及降解特性

申志慧 王亞 李昊聰 卯新蕊 馮發運 任立云 余向陽

摘要：從廢棄農藥廠周邊土壤中分離篩選得到1株以氟環唑為唯一碳源的降解菌，命名為F1。經過對菌落菌體的形態觀察、16S rRNA序列相似性及系統發育分析，初步鑒定其為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）菌株，其親緣關系與昆明假單胞菌（Pseudomonas kunmingensis）最近。進一步優化F1降解氟環唑的條件，結果表明，氟環唑初始濃度為20 mg/L、溫度為30 ℃、pH值為7.0時，菌株降解氟環唑的效果最佳。在最佳條件下，接入菌懸液使無機鹽液體培養基在600 nm處的吸光度（D600 nm）為0.1，培養4 d后，菌株達到生長高峰，培養6 d時氟環唑降解率達90.4%。研究還發現，增加接菌量能明顯提高F1對氟環唑的降解效率。

關鍵詞：農藥;氟環唑;假單胞菌屬;生物修復;影響因子;降解特性

中圖分類號： X592;S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0273-05

收稿日期：2019-10-17

基金項目：國家自然科學基金（編號：31772197）。

作者簡介：申志慧（1991-），女，河南安陽人，碩士研究生，主要從事微生物降解農藥研究。E-mail：1097130928@qq.com。

通信作者：余向陽，博士，研究員，主要從事農產品質量安全研究。E-mail：yuxy@jaas.ac.cn。

氟環唑（epoxiconazole）是一類新型三唑類含氟殺菌劑，具有內吸和殘留活性，可以通過抑制麥角甾醇的形成，阻礙病菌的細胞壁形成[1]，通常用于防治谷物條銹病等多種病害[2]。由于具有良好的內吸性和殺菌活性，氟環唑在殺菌劑市場中所占的份額日漸增大[2-4]，其殘留危害也日漸受到關注。Taxvig等發現，高劑量氟環唑對妊娠期和哺乳期的大鼠有生殖毒性，而低劑量的氟環唑可導致大鼠子代體質量增加，另外可通過參與擾亂類固醇激素合成的關鍵酶對大鼠的胎兒分化及內分泌產生影響[5]。Hester等研究發現，氟環唑能夠引起肝細胞腫大，肝癌細胞增殖，且可對谷胱甘肽S-轉移酶、細胞色素P450和氧化應激的基因轉錄等造成影響[6]。在農業生產中，氟環唑等被大量運用于作物病害防治，它在土壤、水體等環境中的滯留期及非生物降解半衰期較長，給農業生態環境及農產品質量帶來安全隱患[7-8]。

近年來，有研究表明，利用微生物降解有機污染物，進行環境修復是一種安全有效、易于操作、低成本且無二次污染的生物修復技術[9-10]。國內外關于三唑類殺菌劑的降解研究主要集中于戊唑醇[11-15]、丙環唑[15-17]、烯唑醇[18]、三唑醇[19]、苯醚甲環唑[20-21]等上。微生物降解農藥的機制包括酶促反應和非酶促反應，微生物對三唑類農藥的降解大多通過酶促反應，包括氧化、羥基化、脫鹵及還原等反應過程[22]。此外，溫度、濕度、pH值、含氧量等環境因素可能會影響微生物對三唑類農藥的降解效率。目前，有關微生物降解三唑類殺菌劑的研究較多，且以往研究篩選到的菌株對幾種三唑類殺菌劑均有較好的降解效果[11-21]。然而，作為1種新型三唑類殺菌劑，國內外還未發現氟環唑相關降解菌的篩選及其降解特性研究。

本研究篩選到1株對氟環唑有良好降解效果的假單胞菌，初步分析其對氟環唑的降解特性及影響因素，以期為三唑類農藥污染土壤的生物修復提供借鑒和材料。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?樣本來源?土樣采自江蘇省蘇科農化有限責任公司廠區。

1.1.2?主要試劑?95%氟環唑原藥，江蘇輝豐生物農業股份有限公司;98.5%氟環唑標準品，德國Dr. Ehrensterfer公司;色譜純乙腈，德國Darmstadt公司;其他試劑除特別說明外均為分析純。

1.1.3?培養基?無機鹽液體培養基：0.4 gMgSO4·7H2O，0.2 g FeSO4·7H2O，0.2 g K2HPO4，0.2 g （NH4）2SO4，0.08 g CaSO4，去離子水定容至1 000 mL，pH值為7.0±0.2。

LB液體培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，去離子水定容至1 000 mL。LB固體培養基分別在上述液體培養基中加瓊脂15 g/L，pH值為7.0。以上培養基均在溫度為121 ℃條件下，滅菌20 min后，備用。

1.1.4?儀器設備?WH-3微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司;A-1506型紫外可見分光光度計 ，上海奧析科學儀器有限公司;SW-CJ-1D凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;ZQZY-70BF振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司;Five go便攜式pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;Agilent LC/MS-1260/6410液相色譜質譜聯用儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2?氟環唑降解菌的篩選和純化

初篩：取5 g土壤，置于LB液體培養基中富集培養24 h后，依次轉移至含氟環唑50、100、200 mg/L的無機鹽液體培養基中，在30 ℃、200 r/min下培養5 d。利用平板劃線法在LB固體培養基上分離純化菌株，獲得純化菌株8株，分別編號為F1～F8。將菌株F1～F8接種于LB液體培養基中進行富集培養，并將富集的純菌種保存在30%的甘油中，于-60 ℃ 冰箱中保存待用。

復篩：將初篩得到的F1～F8單菌落分別接種于以氟環唑為唯一碳源的無機鹽液體培養基中，在30 ℃、200 r/min 下振蕩培養，以不接菌的處理組為對照，每個處理重復3次。培養6 d后取樣測定氟環唑含量并計算降解率。選擇降解效能高且生長速度快的細菌為目標菌株，進一步研究其降解特性。

1.3?菌株鑒定

細菌16S rRNA的測序與系統發育樹的構建基本步驟如下：提取細菌DNA基因組→16S rRNA PCR擴增→PCR產物瓊脂糖凝膠電泳及純化回收→TA克隆→驗證（陽性）→測序→NCBI比對同源性。16S rRNA擴增引物為通用引物，正向引物為27F（5′-TTGATCMTGGCTCAG-3′），反向引物為1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）;TA克隆后測序的正向引物為M13F（5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3′），反向引物為M13R（5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′）。測序方式為雙向測序，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。將測序結果在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中與具有相似性的細菌16S rRNA序列進行比對，選擇同源性最高（≥97%）的序列，利用ClustalX進行多重序列比對后，用MEGA 6.0軟件進行遺傳距離計算，鄰接法（NJ法）構建細菌的系統進化樹。

1.4?生長曲線測定

將菌種接種于100 mL LB液體培養基中，在30 ℃、200 r/min下振蕩培養，每隔2 h測定1次培養基在600 nm處的吸光度（D600 nm），連續測定24 h，繪制菌株生長曲線。取處于穩定生長期的液體菌種進行氟環唑降解試驗。

1.5?菌株對氟環唑的降解特性

1.5.1?菌懸液制備

將“1.4”節中所得到的菌種接種于LB液體培養基中，放置在30 ℃、200 r/min培養箱中避光培養14 h。取20 mL富集菌液于4 ℃、5 000 r/min 下離心5 min，棄去上清液，用10 mL 無菌水清洗濃縮菌體，重復3次，用5 mL無菌水稀釋后配制成菌懸液母液。

1.5.2?菌株對氟環唑的降解特性及其生長規律

將“1.5.1”節中的菌懸液母液接種到50 mL無機鹽液體培養基中，調整D600 nm為0.1，添加氟環唑至其質量濃度為20 mg/L，測定初始D600 nm和氟環唑含量。以不接菌（加入與接菌液等體積的無菌水）的培養基作為對照，每處理重復3次。于30 ℃、200 r/min 搖床中避光培養，每天定時取樣測定D600 nm及氟環唑殘留量。

1.5.3?溫度和初始pH值對菌株降解效率的影響

用1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸調節無機鹽液體培養基的pH值分別為5、6、7、8、9[培養基中3-（N-嗎啉基）丙磺酸（MOPS）緩沖液濃度為5 mmol/L]。滅菌后，將“1.5.1”節中的菌懸液母液接種到50 mL無機鹽液體培養基中，調整D600 nm為0.1，添加氟環唑使其質量濃度為20 mg/L，分別置于25、30、35 ℃的搖床（轉速為200 r/min）中避光培養6 d后取樣測定培養液中氟環唑的殘留量。每個處理3次重復。

1.5.4?接菌量對菌株降解效率的影響

將“1.5.1”節中的菌懸液母液接種到50 mL滅菌的無機鹽液體培養基（pH值為7.0）中，調整D600 nm分別為0.05、0.10、0.20、0.50，添加氟環唑至其質量濃度為20 mg/L，于30 ℃、200 r/min下避光培養，分別于0、2、4、6 d取樣測定培養液中氟環唑殘留量。每個處理重復3次。

1.5.5?氟環唑質量濃度對菌株降解效率的影響

將“1.5.1”節中的菌懸液母液接種到50 mL無機鹽液體培養基中，調整D600 nm為0.1，添加氟環唑至其初始質量濃度分別為5、10、20、50 mg/L，培養、取樣及測定方法同“1.5.4”節。每個處理重復3次。

1.6?氟環唑提取及分析方法

1.6.1?提取及凈化

采用Quechers法[23]提取氟環唑：取2 mL樣品溶于10 mL乙腈中，添加1 g NaCl渦旋振蕩1 min后，在5 000 r/min下離心5 min，吸取上清液0.5 mL置于10 mL離心管中，加3.5 mL乙腈渦旋振蕩1 min，最后加入0.05 g N-丙基乙二胺和0.100 g無水硫酸鎂進行凈化，過0.22 μm有機系濾膜，待測。

1.6.2?儀器檢測條件

液相色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18（3.5 μm，2.1×150 mm）;流動相比例設置為9 ∶1，其中A相為100%色譜乙腈，B相為0.1%甲酸;等梯度洗脫;流速為0.4 mL/min;進樣體積為5 μL;柱溫為室溫。

質譜條件：多反應監測掃描模式;電噴霧正離子源;離子化電壓為4 000 V;霧化溫度為350 ℃;噴霧氣壓為25 Psi。具體質譜監測參數見表1。

在上述條件下，氟環唑的添加回收率為91.6%～96.5%。

2?結果與分析

2.1?氟環唑降解菌的分離篩選

經過富集培養、梯度馴化、分離純化等過程，得到8株可在含氟環唑的無機鹽液體培養基中生長并可耐受200 mg/L氟環唑的菌株，通過初步降解試驗發現，其中1株菌株能夠以氟環唑為唯一碳源快速生長，且對氟環唑有較好的降解效果，將其命名為F1。在LB固體培養基上，菌落呈白色突起、圓形、邊緣整齊、質地光滑、黏稠。

2.2?菌種鑒定

菌株F1的DNA通過PCR擴增得到約1.4 kb的16S rRNA基因片段，對該基因片段進行測序，并將測序結果在NCBI上進行Blast同源性比對，結果表明，該菌株與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）相似度達99%，將該菌株的16S rRNA序列提交至GenBank，獲得的登錄號為MN515069。使用MEGA6.0軟件構建系統發育樹，結果（圖1）發現，該菌株與昆明假單胞菌Pseudomonas kunmingensis HL22-2同源性最為高。

2.3?降解菌的生長曲線

從圖2可以看出，F1菌株接入LB液體培養基培養4 h后進入對數生長期，10 h后生長速度減緩，到14 h時達到生長高峰。F1菌株處于穩定生長期的時間為培養后14～18 h。取處于穩定生長期的細菌制備成菌懸液母液，進行下一步氟環唑降解試驗。

2.4?菌株F1對氟環唑的降解特性及其生長規律

從圖3可以看出，在以20 mg/L氟環唑為單一碳源的無機鹽液體培養基中，菌株F1的生長繁殖均以氟環唑為唯一碳源和能源，菌株在培養0～4 d內逐步生長繁殖，同時氟環唑被快速代謝;在培養4 d 后因氟環唑含量降低，菌株生長進入衰退期（數量減少），氟環唑降解速率降低。在培養4 d時菌株F1數量達到最大值，其對氟環唑的降解率達75.3%;至培養6 d時，氟環唑的殘留量為1.92 mg/L，降解率達到90.4%，而在未接菌的處理中，氟環唑的自降解率僅為12.8%，表明接菌處理組培養基中氟環唑濃度的下降主要是由于菌株F1的作用。

2.5?菌株F1對氟環唑降解條件的優化

2.5.1?溫度和初始pH值對菌株F1降解氟環唑的影響?從圖4可以看出，在pH值為6.0～8.0范圍內，菌株F1對氟環唑的降解效率較高，最適初始pH值為7.0，pH值過高或者過低均會影響菌株的生長及對氟環唑的降解率。在相同pH值、不同溫度（25～35 ℃）條件下，菌株F1在25 ℃下生長較慢，對氟環唑的降解能力也最小;在30 ℃ 下菌株F1對氟環唑降解效率最高，培養6 d后氟環唑降解率達90.1%。

2.5.2?接菌量對菌株F1降解氟環唑的影響?從圖5可以看出，在底物氟環唑濃度均是20 mg/L的無機鹽液體培養基中，隨著初始接菌量的逐漸增加，菌株F1對氟環唑的降解效率明顯提高。接菌量（即無機鹽培養基的D600 nm）在0.05～0.50范圍內時，培養6 d后菌株F1對氟環唑的降解率為22.0%～92.1%;其中當接菌量為0.05時，菌株F1的適應期延長，氟環唑降解緩慢;當接菌量分別為0.10、0.20時，菌株F1在培養4 d內快速降解氟環唑，隨后降解速率變緩;而當接菌量為0.50時，菌株F1在培養2 d內快速降解氟環唑，之后降解速率變慢。

2.5.3?氟環唑底物濃度對菌株F1降解氟環唑的影響?從圖6可以看出，在菌株F1接菌量為0.10、底物氟環唑的質量濃度為5～50 mg/L時，培養6 d后，隨著初始氟環唑濃度的增加，降解率呈現先增加后降低的趨勢。當底物濃度為50 mg/L時，推測由于底物濃度較大，菌株F1適應時期較長，導致培養6 d后氟環唑的降解率僅為38%;當底物濃度低于或等于20 mg/L時，菌株F1快速降解氟環唑，培養6 d后降解率均高于80%，表明該菌株對濃度低于或等于20 mg/L的氟環唑有較高的降解效果。

3?結論與討論

本研究在農藥廠區污染土壤中采樣，經過以氟環唑為唯一碳源的梯度馴化、分離純化等步驟，得到1株對氟環唑降解性能較好的菌株F1。經過16S rRNA同源性比較分析，初步鑒定該菌株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），其親緣關系與昆明假單胞菌Pseudomonas kunmingensis最為接近。目前已報道的三唑類（戊唑醇[13]、丙環唑[17]、多效唑[24]）農藥降解菌大多屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。假單胞菌屬細菌是從污染物中分離出的常見菌株，且大部分種屬對人類危害較小，有望應用于三唑類農藥污染環境的微生物修復。

本研究表明，菌株F1降解氟環唑的最佳環境條件是pH值為6.0～8.0，溫度為30 ℃。細菌都具有一定的最適pH值和溫度生長范圍，其中溫度通過控制微生物的酶促反應速率來影響降解菌的生長，進而影響降解菌對農藥的降解速率[22]。當氟環唑初始濃度為20 mg/L，接菌量（D600 nm）為0.1，pH值為7.0，溫度為30 ℃時，培養6 d后，氟環唑降解率達90.4%。除以上影響因素外，能源物質的添加也可能影響微生物對農藥的降解效率。Sarkar等研究表明，葡萄糖作為碳源物質或硝態氮作為氮源物質的加入均能促進微生物對土壤中三唑類殺菌劑的降解作用[17]。在氟環唑的降解過程中是否具有類似的規律，需要進一步研究。

菌株F1是1株降解氟環唑功效良好的降解菌，對主要影響因素適應性良好，但還需進一步研究該菌株介導的氟環唑代謝途徑及降解氟環唑過程中起關鍵作用的酶或控制基因等。另外，該菌株對其他三唑類農藥的降解效果如何還需要進一步研究。目前，國內外對氟環唑的生物降解研究尚無報道，本研究為三唑類農藥氟環唑的生物降解提供了微生物資源。該降解菌在已被氟環唑污染的化工廢水及農田環境的生物修復中可能具有良好的應用前景。

參考文獻：

[1]閆立單，顧松山，余?強. 氟環唑的合成新工藝[J]. 中國農藥，2012（12）：14-16.

[2]王新茹，趙建昌，白?偉，等. 幾種三唑類殺菌劑對小麥條銹病的防治效果[J]. 麥類作物學報，2008，28（4）：705-708.

[3]邱勇波，張曉蕾. 殺菌劑氟環唑的合成新方法[J]. 化學試劑，2017，39（2）：218-220.

[4]劉麗秀，張魯新，張亞敏. 氟環唑的合成工藝研究進展[J]. 山東化工，2009，38（4）：28-30，41.

[5]Taxvig C，Hass U，Axelstad M，et al. Endocrine-disrupting activities in vivo of the fungicides tebuconazole and epoxiconazole[J]. Toxicological Sciences，2007，100（2）：464-473.

[6]Hester S，Moore T，Padgett W T，et al. The hepatocarcinogenic conazoles：cyproconazole，epoxiconazole，and propiconazole induce a common set of toxicological and transcriptional responses[J]. Toxicological Sciences，2012，127（1）：54-65.

[7]吳文鑄，郭?敏，孔德洋，等. 3種三唑類殺菌劑的環境降解特性[J]. 生態與農村環境學報，2016，32（5）：837-841.

[8]顧晨凱，陳茜茜，陳?猛，等. 自然條件下水中三環唑、氟環唑和苯醚甲環唑的非生物降解及其影響因素[J]. 環境化學，2014，33（1）：30-36.

[9]Singh D K. Biodegradation and bioremediation of pesticide in soil：concept，method and recent developments[J]. Indian Journal of Microbiology，2008，48（1）：35-40.

[10]滕?應，駱永明，李振高. 污染土壤的微生物修復原理與技術進展[J]. 土壤，2007，39（4）：497-502.

[11]吳紅萍，萬紅艷，王銳萍. 戊唑醇農藥降解菌的篩選及其降解效能初探[J]. 農藥，2013，52（2）：102-104.

[12]侯曉娟，趙巍巍，楊?茜，等. 戊唑醇降解菌B1的培養基優化[J]. 吉林農業大學學報，2019，41（1）：23-28.

[13]Obanda D N，Shupe T F. Biotransformation of tebuconazole by microorganisms：evidence of a common mechanism[J]. Wood and Fiber Science，2009，41（2）：157-167.

[14]Sehnem N T，Souza-Cruz P，Peralba M D，et al. Biodegradation of tebuconazole by bacteria isolated from contaminated soils[J]. Journal of Environmental Science and Health（Part. B，Pesticides，Food Contaminants，and Agricultural Wastes），2010，45（1）：67-72.

[15]Woo C，Daniels B，Stirling R，et al. Tebuconazole and propiconazole tolerance and possible degradation by Basidiomycetes：a wood-based bioassay[J]. International Biodeterioration & Biodegradation，2010，64（5）：403-408.

[16]李體文，魏朝俊，賈臨芳，等. 丙環唑降解菌篩選的初步研究[C]//農業環境與生態安全——第五屆全國農業環境科學學術研討會論文集，2013.

[17]Sarkar S，Seenivasan S，Premkumar R. Biodegradation of propiconazole by Pseudomonas putida isolated from tea rhizosphere[J]. Plant Soil and Environment，2009，55（5）：196-201.

[18]張鳳霞，李學德，花日茂，等. 烯唑醇降解菌的分離篩選及降解特性研究[J]. 激光生物學報，2009，18（5）：591-595，603.

[19]鹿文紅. 三唑醇降解菌的篩選與降解特性研究[D]. 長春：吉林農業大學，2014.

[20]蔡慧敏，曹之富，趙建莊，等. 苯醚甲環唑降解菌BMJHZ-01的分離鑒定及降解影響因素[J]. 農藥學學報，2015，17（5）：590-595.

[21]鄭金偉，何?健，王?哲，等. 苯醚甲環唑降解菌B2的分離、鑒定及其降解特性[J]. 中國環境科學，2009，29（1）：42-46.

[22]田春燕，徐?軍，董豐收，等. 微生物降解三唑類殺菌劑研究進展[J]. 農藥學學報，2016，18（2）：141-150.

[23]Annastasiades M，Lehotay S J，tajnbaher D，et al. Easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitiioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce[J]. Journal of AOAC International，2003，86（2）：412-413.

[24]Chen J，Xu L，Giesy J P，et al. Biodegradation of paclobutrazol by a microbial consortium isolated from industrially contaminated sediment[J]. Toxicological and Environmental Chemistry，2010，92（8）：1487-1494.