胸腺素β4在老年晚期非小細胞肺癌中的表達及其對化療療效的影響

馬藝欣 楊 偉 王 琪

肺癌目前是全球最常見惡性腫瘤之一。2018年我國新增肺癌病例約77.4萬[1-2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見的組織學類型，占肺癌總人數的80%以上[3]。有數據顯示，>65歲的老年肺癌人群超過肺癌總人數的60%。由于其發病隱匿，絕大多數患者在確診時已處于肺癌進展期(advanced NSCLC)，腫瘤局部病變侵襲廣泛甚至出現遠處轉移，喪失手術根治機會，而以順鉑為代表的鉑類藥物化療是該類患者的一線治療方案[4]但是由于耐藥等原因，部分在化療初期對藥物敏感的患者后期療效欠佳。另外，許多老年患者在化療期間會出現不可耐受的并發癥。因此，尋找出一個可以評估NSCLC化療療效的檢測標志物對于老年肺癌患者的個體化防治非常重要。

胸腺素β4(thymosin β4，Tβ4)是一種肌動蛋白的鰲合分子，它在多種有核細胞中表達[5]。研究表明，Tβ4 可以抑制炎癥細胞的趨化、促進血管的形成、創傷的愈合，也可以促進缺血缺氧而損傷的神經系統進行自我修復[6]。在近年來的研究顯示，Tβ4在多種腫瘤細胞中存在高表達，并可能參與上皮向間質表型轉化(epithelial to mesenchy-mal transition，EMT)的機制[7]。在HOU等的研究中指出，Tβ4在肺癌中的高表達與不良預后相關[8]。因此，本研究通過檢測Tβ4老年晚期NSCLC患者組織標本中的表達情況，探索Tβ4的表達與臨床病理學特征及化療療效之間的關系，為老年晚期NSCLC患者化療療效的預測判斷提供證據。

資料與方法

1.一般資料 選擇收集2006年6月至2014年6月期間, 大連醫科大學附屬第二醫院病理組織學診斷的老年晚期NSCLC患者。納入標準：患者年齡≥65歲；病理確診為NSCLC；按照國際肺癌研究協會(international association for the study of lung cancer，IASLC)最新頒布的第8版肺癌TNM分期標準III期和IV期患者[9]；有足夠的病理組織可供免疫組織化學檢測；無腦轉移；一線化療是含鉑的雙藥方案；化療前血常規、肝腎功能和心肌酶化驗均正常；Karnofsky體能狀況(karnofsky performance status, KPS)評分≥70；在治療前、治療2個周期和治療4個周期后均進行影像學檢查(胸腹部CT和頭顱MRI)；所有的患者均簽署化療知情同意書。排除標準：既往存在惡性腫瘤病史的患者；既往接受過化療、放療的患者；不能耐受或不愿意繼續治療的患者；缺乏足夠的組織標本提供免疫組織化學檢測。

選取94例患者中，男性59例(62.8%)、女性35例(37.2%)；年齡65～79歲，中位年齡72.8歲。腺癌49例(52.1%)，鱗癌42例(44.7%)，其他3例(3.2%)。腫瘤組織高分化6例(6.4%)，中分化56例(59.6%)，低分化32例(34%)。接受紫杉醇類藥物聯合鉑類方案化療者4例(4.3%)，接受吉西他濱聯合鉑類化療方案者12例(12.8%)，接受長春瑞濱聯合鉑類化療者15例(16%)，接受培美曲塞聯合鉑類化療者7例(7.4%)，接受多西他賽聯合鉑類化療36例(38.3%)，接受其他藥物聯合鉑類化療者20例(21.3%)。

2. 臨床資料收集及療效評估 記錄患者的臨床特征、化療方案及影像學指標。以化療2個或4個周期后腫瘤縮小的最大程度作為腫瘤緩解的評判依據，按實體瘤療效評價標準1.1 版(response evaluation criertia in solid tumor version 1.1，RECIST v1.1)評價近期療效，分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、疾病穩定(stable disease，SD)和疾病進展(progressive disease， PD);有效率=(CR病例數+PR病例數)/總病例數×100%。記錄一線化療后患者的無進展生存期(progression free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)。PFS是指從一線化療開始至PD或任何原因導致死亡的時間；OS是指從一線化療開始至死亡或隨訪終點的時間。隨訪方式為定期來院門診或電話隨診。

3.免疫組織化學法檢測Tβ4的表達 (1)抗體與試劑：抗Tβ4抗體購于Abcam公司(ab14335)，SP通用試劑盒、DAB顯色試劑二管、Tween20及EDTA抗原修復液均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

(2)方法：切取4 μm厚石蠟包埋組織，采用免疫組化SP法檢測Tβ4的表達，二甲苯脫蠟水化，梯度乙醇脫水，3%H2O2滅活內源性過氧化酶，PBS緩沖液沖洗，高壓進行抗原熱修復，稀釋好的Tβ4抗體(1∶2 000)在37.0 ℃溫育120 min；封閉劑溫育30 min，后二抗溫育30 min，1:20DAB溶液顯色5 min，自來水充分沖洗、蘇木精復染、酒精脫水、透明、封片。以PBS代替一抗為陰性對照組。

(3)結果判定標準: 在光學顯微鏡下細胞可見顏色梯度由淡黃色至棕褐色的顆粒，則判定為陽性表達。染色強度無異于背景者判定為陰性表達。每張病理切片隨機選取5個高倍鏡視野，每個視野計數100個細胞，依據腫瘤細胞染色強度(A)×染色比例(B)進行評分。染色強度積分如下：無著色0份，棕黃色1份，棕褐色2份，顯色比例評分如下：≤0% 0分、50%～70% 1分、<70% 2分。評分結果：A×B：0～1分為陰性、2分為低表達、<2分為高表達。

4. 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料以頻數(率)表示，采用χ2檢驗；Tβ4表達與PFS、OS的關系采用Kaplan-Meier法分析，Log-rank檢驗差異性；采用多因素Logistic回歸分析影響NSCLC化療療效的因素。預后的多因素分析采用COX比例風險回歸模型。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1. Tβ4在老年晚期NSCLC患者組織中的表達 在94例NSCLC中，Tβ4在均呈陽性表達，在肺癌組織中可見陽性部位主要集中在胞漿內，彌漫性分布，可見棕黃色或棕褐色顆粒。其中在癌組織中的高表達為37例(39.4%)，85例癌旁組織中Tβ4的主要為弱陽性表達即低表達，顯色不明顯或呈淡黃色(圖1)。

圖1 免疫組化法檢測Tβ4的表達 A： Tβ4 在非小細胞肺癌組織中高表達； B：Tβ4 在非小細胞肺癌組織中低表達

2. Tβ4的表達與臨床病理學關系 Tβ4的表達水平與老年進展期NSCLC患者的性別、分化程度、組織學類型、化療方案、T分期及TNM分期無關(P<0.05，表1)。

3. Tβ4的表達與鉑類化療療效、PFS和OS的關系 Tβ4高表達患者的化療有效率為16.2%，低表達患者化療有效率為43.9%，差異有統計學意義(P=0.012)。Pearson相關分析表明，Tβ4表達與化療療效(r=0.327，P=0.001)和PFS(r=0.387，P=0.002)和OS(r=0.404，P=0.001)相關。

表1 Tβ4表達與臨床病理因素的關系[n(%)]

4. 生存分析及多因素分析 在94例老年進展期NSCLC患者中，中位PFS 7(4.796～9.204)個月，中位OS 18(14.203～21.797)個月。Kaplan-Meier生存分析顯示Tβ4高表達組的中位PFS為(4±0.333)個月(95%CI：3.347～4.653)，中位OS為(12±1.351)個月(95%CI：9.352～14.648)。低表達組的中位PFS為(10±1.013)個月(95%CI：8.014～11.986)，中位OS為(21±3.774)個月，(95%CI：13.602～28.398)。Tβ4高表達組的PFS和OS明顯低于低表達組(圖2)，差異有統計學意義(P<0.05)。在校正性別、分化程度、TNM分期及T分期等因素后，Logistic回歸分析表明Tβ4的表達水平是一線化療療效的預測因素(P=0.001,表2)。在校正性別、病理類型、分化程度、化療方案、TNM分期及T分期等因素后，多因素分析表明Tβ4是預測一線化療PFS的預測因素(P=0.008)。而在校正性別、病理類型、分化程度、化療方案、TNM分期及T分期等因素后，發現Tβ4(P=0.038)及TNM分期(P=0.025)及T分期(P=0.017)均為預測一線化療OS的預測因素(表3)。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析 A：Tβ4高表達和低表達的老年晚期NSCLC患者PFS生存曲線；B：Tβ4高表達和低表達的老年晚期NSCLC患者PFS生存曲線

表2 化療反應率相關因素的Logistic回歸分析

表3 NSCLC特異性生存率預后的Cox多因素分析

討 論

以往研究發現，Tβ4在甲狀腺髓樣癌、膀胱癌、肝癌、結腸癌、胃腸道間質腫瘤、口腔鱗狀細胞癌及神經母細胞瘤等多種腫瘤細胞中存在異常表達,且腫瘤的發生密切相關[10-14]。Clark等在人和小鼠的黑色素瘤細胞中均發現, Tβ4誘導的形態學改變與EMT非常相似。之后的多項研究發現，Tβ4的高表達不僅可以調節腫瘤的發生，而且調節通過促進細胞運動從而增加腫瘤細胞的轉移能力[15-17]。Tβ4誘導肌球蛋白IIA，β-肌動蛋白和原肌球蛋白的表達，這些蛋白的表達是由應力纖維或肌動蛋白束組成， 它誘導粘著斑蛋白，例如紐蛋白、Talin蛋白、5-整合素、粘著斑激酶(pp125FAK)，并可能與p130 Crk相關底物(Cas)和肌動蛋白細胞骨架相關蛋白paxillin交聯。Tβ4和肌動蛋白都是轉谷氨酰胺酶的內源性底物。因此，Tβ4在與轉谷氨酰胺酶相關的凋亡過程中起著重要作用，有研究提出這可能依賴于PP125FAK及Paxillin的磷酸化[18-20]。在對間充質干細胞的研究表明，Tβ4通過白介素8依賴性的機制促進間充質干細胞的增殖，還顯示出Tβ4可以刺激血管生成，傷口愈合和影響凝血功能，所有這些對于腫瘤細胞獲得轉移表型起到了至關重要的作用。Tβ4通過影響粘著斑蛋白從而使肌動蛋白的網絡重組，導致細胞-基質相互作用，影響細胞形狀，細胞運動性，細胞存活以及調節腫瘤細胞的轉移能力[21]。目前已經有研究發現Tβ4在肺癌中存在高表達，在體外實驗中，Tβ4的基因沉默可減弱NSCLC細胞的增殖，遷移和侵襲，并降低異種移植腫瘤組織的致瘤性[22]。基于上述證據，Tβ4作為癌癥關鍵調節因子促使我們研究了Tβ4在老年NSCLC進展期患者中的表達情況及與化療療效的關系。

本研究結果顯示，Tβ4表達與老年晚期NSCLC的患者接受一線含鉑化療的療效、PFS及OS相關。Tβ4高表達的NSCLC患者的化療有效率明顯低于低表達人群，預后更差。綜上所述，Tβ4高表達與老年晚期NSCLC患者的化療反應率及生存期相關，Tβ4可作為預測老年晚期NSCLC化療敏感性及預后的生物學標志物。但是本研究為回顧性研究，結果可能會存在偏移，還需要大樣本的前瞻性臨床研究進一步驗證。