CⅡTA表達與喉鱗狀細胞癌（LSCC）患者預后的關(guān)系

薛 乙 湯 迪 翟長文 袁存存 衡 宇 周 梁 陶 磊△ 路麗明

（1復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科，2病理科 上海 200031；3上海交通大學醫(yī)學院免疫研究所 上海 200025）

喉癌是頭頸部腫瘤中最常見的類型［1］。喉癌中最常見的病理類型是喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC），約占 96%［2］。喉癌的主要病因是吸煙、飲酒、老年和男性［3-4］。目前LSCC的治療方法主要有手術(shù)、放療和化療等，盡管診療手段不斷提高，但在過去40年LSCC術(shù)后5年的生存率并無明顯改善［5］。因此迫切需要探索新的治療方法或預測LSCC術(shù)后與預后相關(guān)的生物學指標，為治愈或延緩進展提供新的策略。

MHC-Ⅱ類反式激活蛋白（classⅡtrans-activator，CⅡTA）屬于NOD樣受體家族成員，是參與機體炎癥反應的主要成分［6］。炎癥是參與腫瘤形成的重要因素之一［7］。CⅡTA是調(diào)節(jié)MHC-Ⅱ分子調(diào)控的主控開關(guān)，也是IFN-γ激活MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵基因［8］。CⅡTA所調(diào)控的 MHC-Ⅰ/Ⅱ分子的表達水平與頭頸部腫瘤免疫逃逸機制有密切的關(guān)系，表明CⅡTA在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中的重要性［9］。MHC-Ⅱ分子高表達的腫瘤通常預后較好，如非小細胞性肺癌［10］、肝鱗狀細胞癌［11］等，而CⅡTA表達與腫瘤預后關(guān)系的研究較少，然而最近研究發(fā)現(xiàn)CⅡTA高表達的腫瘤與較好的預后相關(guān)［11-12］，這引起了我們對CⅡTA表達水平與LCCC預后關(guān)系進行探索性研究。

關(guān)于CⅡTA表達與LSCC患者預后關(guān)系的研究國內(nèi)外尚未見報道。本研究結(jié)合CⅡTA在LSCC組織的表達水平與LSCC患者臨床特征進行相關(guān)性分析，并對CⅡTA表達水平與LSCC患者的預后進行初步研究，以期對LSCC的診療或預后評估提供新的思路。

資料和方法

臨床資料本研究經(jīng)復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準（編號KJ200801），所有患者均簽署知情同意書。收集我院2013年9月至2015年6月收治的80例喉癌患者術(shù)后的腫瘤組織樣本并制作成組織芯片。入組標準：（1）首次行腫瘤根治性手術(shù)，且術(shù)前未接受過放療、化療；（2）確診為喉鱗狀細胞癌（術(shù)后病理）；（3）隨訪和臨床病例資料完整。排除標準：（1）喉非鱗狀細胞癌（神經(jīng)內(nèi)分泌癌，腺癌，梭形細胞癌等）；（2）伴有其他腫瘤病史；（3）伴有全身系統(tǒng)性疾病病史（系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風濕關(guān)節(jié)炎等）。根據(jù)上述標準，排除非鱗狀細胞癌4例，伴有其他腫瘤1例，失訪5例，術(shù)前放療患者3例，最終納入67例。喉癌的TNM臨床分期參考第8版美國癌癥協(xié)會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）制定的標準。吸煙和飲酒人群的界定為：吸煙≥20支/天（持續(xù)時間≥1年）；飲酒≥200 mL/d（持續(xù)時間≥1年）。目前已經(jīng)戒煙/戒酒的人群（曾經(jīng)吸煙/飲酒），統(tǒng)計為有吸煙史/飲酒史。隨訪終止時間為2018年10月16日，隨訪終止或患者死亡為觀察終止時間，總生存期（overall survival，OS）為LSCC術(shù)后到觀察終止時間。

免疫組化免疫組化主要試劑：一抗，兔抗人多克隆CⅡTA抗體（美國Novus公司，NBP2-59072）；二抗，HRP山羊抗兔（中國Beyotime公司，A0208）；山羊血清（英國Abcam公司，ab7481）。參考CⅡTA免疫組織化步驟，完成實驗。首先，二甲苯浸泡脫蠟，梯度酒精（100%、95%、70%、50%）脫水各5 min；封閉內(nèi)源性過氧化物酶（3%H2O2，15 min），PBS漂洗 3遍（5 min/遍）；抗原修復，抗原修復液（ddH2O：檸檬酸鈉緩沖液=100∶1），微波爐（高火10 min，解凍2 min，中火7 min），待恢復至室溫取出；加入一抗（1∶300山羊血清稀釋；對照組加入PBS）；4℃過夜；16 h后取出：依次用PBST、PBS漂洗（均為3遍，5 min/遍）；加入二抗（1∶50山羊血清稀釋）；PBS漂洗3次（每次5 min），DAB顯色5 min左右，顯微鏡檢查染色情況，蘇木素復染，進行后續(xù)處理，封片。

免疫組化結(jié)果分析光學顯微鏡下觀察位點染色情況，選取3個不同的視野，按照染色程度與面積計算染色的強弱，每次評分均由2位病理科醫(yī)師雙盲獨立完成，且由第3位病理科醫(yī)師復評以確保結(jié)果的準確性。染色強度評分：0（-），1（+），2（++），3（+++）。染色面積評分：0（0），1（1%～25%），2（26%～50%），3（51%～75%），4（76%～100%）。根據(jù)染色面積乘以染色強度的結(jié)果分為：CⅡTA低表達組（0～6分）；CⅡTA高表達組（7～12分）。LSCC的腫瘤/間質(zhì)細胞表達，均可認為CⅡTA表達陽性。

GEPIAGEPIA是一種新開發(fā)的網(wǎng)絡服務器，基于癌癥基因數(shù)據(jù)庫（TCGA）和基因組織表達數(shù)據(jù)庫（GTEx），且有腫瘤（9 736個）和正常樣本（8 587個）的RNA測序表達數(shù)據(jù)。GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）可提供多種功能［13］，如腫瘤患者生存分析、類似基因的檢測以及某種基因在腫瘤或正常組織表達的差異性分析等。利用GEPIA分析CⅡTA的表達與頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squanmous cell carcinoma，HNSCC）患者預后的關(guān)系。

統(tǒng)計學分析采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。用χ2檢驗分析CⅡTA的表達水平與LSCC患者臨床特征的關(guān)系。用Kaplan-Meier法分析LSCC患者術(shù)后5年的OS，Log-rank檢驗計算P值。對CⅡTA表達情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素進行Cox比例風險模型多因素回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

LSCC癌組織中CⅡTA表達水平與患者臨床特征的關(guān)系本次研究共納入67例患者（男性66例，女性1例），年齡38～84歲，平均61歲。根據(jù)免疫組化結(jié)果，分為CⅡTA高表達組（圖1A）和低表達組（圖1B）。對CⅡTA的表達與患者年齡、性別、吸煙、飲酒、臨床分期、喉癌分型、腫瘤大小等臨床特征的關(guān)系進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示CⅡTA的表達水平與LSCC患者臨床特征的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

圖1 LSCC腫瘤組織中CⅡTA的免疫組化結(jié)果Fig 1 IHC results of CⅡTA in LSCC tumor tissues

COX回歸多因素分析結(jié)果本研究將CⅡTA的表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、飲酒等臨床指標納入COX多因素回歸模型，結(jié)果顯示飲酒、CⅡTA的表達水平、腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與LSCC患者術(shù)后生存時間密切相關(guān)（表2）。飲酒、CⅡTA的表達及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為LSCC術(shù)后OS的獨立影響因素。

LSCC癌組織中CⅡTA表達水平與預后的關(guān)系67例LSCC患者，死亡33例，生存34例。CⅡTA高表達組41例，平均生存時間（49.3±2.6）個月，5年生存率為41.5%（24/41）；CⅡTA低表達組26例，平均生存時間（35.3±3.9）個月，5年生存率為38.5%（10/26）。Kaplan-Meier法分析LSCC患者術(shù)后5年的OS結(jié)果顯示，CⅡTA高表達比CⅡTA低表達的患者預后好（圖2A，P＜0.05）。

TCGA數(shù)據(jù)庫CⅡTA表達與HNSCC預后的關(guān)系運用TCGA數(shù)據(jù)庫對CⅡTA的表達與HNSCC的預后進行分析，可結(jié)合CⅡTA表達與LSCC預后的關(guān)系進行與之對比分析。結(jié)果顯示，HNSCC患者中CⅡTA高表達組比低表達組預后好（圖2B，P＜0.05）。

表2 多變量Cox比例回歸生存分析Tab 2 Multivariate Cox proportional regression survival analysis

圖2CⅡTA與LSCC/HNSCC預后的關(guān)系Fig 2 Relationship between CⅡTA and prognosis of LSCC/HNSCC

討 論

隨著MHC-Ⅰ/Ⅱ分子在腫瘤免疫逃逸的作用及機制的研究不斷明確，人們逐步認識到CⅡTA在腫瘤免疫的重要性。CⅡTA基因的缺陷會導致裸淋巴細胞綜合征［14］，而CⅡTA分子的表達異常與頭頸部鱗狀細胞癌［15］、原發(fā)性縱隔大 B 細胞淋巴瘤［16］等疾病發(fā)生相關(guān)。Yazawa等［17］認為腫瘤細胞表達的MHC-Ⅱ分子可以將抗原肽呈遞給輔助性T淋巴細胞，有助于抗腫瘤免疫反應。最近有研究認為CⅡTA在不同腫瘤組織中的表達，其預后也不盡相同［12，18］，這為探索CⅡTA表達與腫瘤的關(guān)系提供了一定的研究基礎。我們對CⅡTA分子表達水平與LSCC患者術(shù)后預后的關(guān)系進行了初步的研究。

CⅡTA可在多種腫瘤組織中表達，如三陰性乳腺癌［12］、原發(fā)性縱隔大 B細胞淋巴瘤［16］、脂肪肉瘤［19］等。根據(jù)IHC結(jié)果，我們分析認為CⅡTA在LSCC的腫瘤細胞以及部分腫瘤間質(zhì)細胞中均有表達。并將CⅡTA表達情況分為高表達組（圖1A）和低表達組，對CⅡTA的表達水平與LSCC的臨床特征進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學意義，結(jié)果可能與研究樣本量的多少有關(guān)，值得進一步研究。盡管CⅡTA表達與LSCC臨床特征的分析無統(tǒng)計學差異，而Cox比例風險模型多因素回歸分析結(jié)果顯示飲酒、CⅡTA表達及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是LSCC術(shù)后生存時間的獨立影響因素（P＜0.05），這表明LSCC的發(fā)生可能是一個復雜的多因素結(jié)果。

Kaplan-Meier法對LSCC術(shù)后5年的生存分析顯示，CⅡTA高表達比低表達的LSCC患者術(shù)后預后好，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Xie等［11］研究認為，肝鱗狀細胞癌腫瘤組織中CⅡTA高表達經(jīng)常伴有MHC-Ⅱ分子的表達，且術(shù)后的無進展生存期更長。Forero等［12］在對三陰性乳腺癌患者術(shù)后長達11年的隨訪后認為，CⅡTA高表達的三陰性乳腺癌有較好的預后，CⅡTA表達是三陰性乳腺癌術(shù)后無進展生存期的獨立預后因素。我們推測CⅡTA高表達的LSCC患者預后較好可能與MHC-Ⅱ分子的表達增加相關(guān)，其在LSCC腫瘤微環(huán)境中增強一系列的免疫應答反應，加強機體對腫瘤細胞的殺傷能力。我們運用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析CⅡTA的mRNA水平對HNSCC患者的預后價值，對研究結(jié)果進行輔助性驗證，結(jié)果顯示CⅡTA高表達組比低表達組預后好，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

然而，有研究認為CⅡTA的表達可能是增加腫瘤患者死亡風險的重要因素。Tan等［18］認為CⅡTA表達升高能夠增加腎透明細胞癌的死亡風險，CⅡTA的過表達誘導腫瘤細胞表達MHC-Ⅱ分子參與免疫反應，加劇機體的免疫炎癥反應而導致癌癥進展加快。CⅡTA表達水平與腫瘤預后的關(guān)系不同，這可能與CⅡTA分子所處的腫瘤微環(huán)境不同密切相關(guān)，以至于CⅡTA在不同腫瘤類型發(fā)揮的作用可能不同，仍待進一步的研究和探討。本研究仍有許多局限性：納入的臨床病例樣本量不夠大；納入的女性LSCC病例數(shù)相對較少；隨訪時間不夠長。

總之，CⅡTA作為調(diào)控MHC-Ⅱ分子表達的關(guān)鍵基因，在參與腫瘤免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示CⅡTA高表達的LSCC患者比低表達者預后好（OS）。本研究結(jié)果提示CⅡTA表達水平可能對LSCC患者術(shù)后診療及預后的預測有一定的參考意義。