頭頸部鱗狀細胞癌相關DNA甲基化的研究進展

方 一（綜述） 陳 健 吳海濤（審校）

（復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻咽喉科 上海 200031）

頭頸部惡性腫瘤的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排第6位，其中以頭頸部鱗狀細胞癌（簡稱頭頸鱗癌）為主，2012年全球范圍內共造成約78萬人死亡，占癌癥總死亡率的10%［1］。隨著臨床醫(yī)學的發(fā)展和檢測技術的進步，早期診斷的頭頸鱗癌患者生存率可高達75%～80%，但大部分患者直到晚期才被確診，遠期生存率僅為35%［2］。早期診斷成為提高頭頸鱗癌患者生存率的關鍵之一。癌前病變是指特定器官存在的良性病變，易出現(xiàn)細胞異常增生，具有惡變傾向，對于監(jiān)測惡性腫瘤的發(fā)生具有重要的意義［3］。DNA甲基化是一種針對DNA 5'端核苷酸胞嘧啶的共價修飾，可以在不改變基因序列的前提下調節(jié)DNA的轉錄活性等，并保護DNA位點不被特定限制酶降解，是目前已知表觀遺傳學中DNA修飾的唯一方式［4］。已有大量研究證明DNA甲基化與腫瘤有關，且多發(fā)生在腫瘤生成的早期階段，并參與惡性腫瘤的進展和轉移［5-6］，根據(jù)腫瘤甲基化數(shù)據(jù)庫 PubMeth（www.pubmeth.org），常 見 的 與DNA甲基化有關的腫瘤是肺癌、胃癌、結直腸癌、白血病、腦瘤、肝癌、乳腺癌和前列腺癌，而其在頭頸部腫瘤中的研究相對較少。因此，本文對DNA甲基化在頭頸鱗癌中的作用進行綜述。

DNA甲基化在腫瘤發(fā)生中的作用1950年Wyatt等［7］首次報道真核細胞中存在核酸甲基化的現(xiàn)象。1983年Feinberg等［8］系統(tǒng)總結了腫瘤細胞中DNA甲基化的情況，并使該領域得到重視。DNA甲基化通過共價化學修飾在5'端胞嘧啶添加甲基基團，通常導致基因位點的沉默。除少數(shù)位于5'-CA-3'和5'-CT-3'序列，甲基化最常發(fā)生在5'-CG-3'序列中（也被稱為CpG二核苷酸）。人類基因組中大部分序列中存在DNA甲基化現(xiàn)象，約每100 kb會出現(xiàn)長度為0.5～5 kb的特殊區(qū)域，其中富含未甲基化的CG序列（60%～70%），被稱為CpG島。CpG島存在于人類基因組大半的基因轉錄起始位點，即主要位于中高度轉錄活性或者保持靜止的基因，如管家基因和組織特異性基因。因而基因組、尤其是CpG島內的異常甲基化將會改變序列表達的起始位置，進而導致表型的改變。

腫瘤細胞中的異常DNA甲基化常出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生的早期階段，基因位點過甲基化和全基因組低甲基化的特點，其中對過甲基化的研究遠多于后者。多項針對腫瘤過甲基化的研究證明其通常與抑癌基因的沉默有關，進而導致細胞周期、細胞凋亡或基因穩(wěn)定性的改變。Flavahan等［9］發(fā)現(xiàn)，異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）的原發(fā)突變通過影響10-11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白，使得鎘離子結合蛋白質CTCF結合位點出現(xiàn)過甲基化，進而激活成瘤基因血小板源性生長因子受體α多肽，促進膠質瘤的發(fā)生。另一項關于小細胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）的研究指出，RAS相關區(qū)域家族1A（RASSF1A）位點是防止細胞產(chǎn)生干細胞樣增殖的“天然屏障”，而40%SCLC患者中存在RASSF1A位點內增強子的異常甲基化，導致該位點沉默，失去其腫瘤抑制作用［10］。

腫瘤全基因組的低甲基化狀態(tài)同樣在惡性腫瘤中普遍存在。目前認為低甲基化狀態(tài)下成瘤基因更易被激活，從而促進腫瘤生成。Wu等［11］研究發(fā)現(xiàn)，全長配對盒基因2是調節(jié)子宮內膜細胞增殖和生長的關鍵性基因，其因在子宮內膜癌中的異常激活而被認為是成瘤基因，并與他莫昔芬的耐藥有關，而該位點增強子的異常激活已被證實與腫瘤相關低甲基化有關。其次，低甲基化導致的活動性DNA信息載體異常與腫瘤相關。DNA甲基轉移酶抑制子觸發(fā)胞質內雙鏈DNA（dsDNA）受體，從而促進異常細胞的凋亡，而敲除該受體則會促進卵巢癌、惡性黑色素瘤和其他腫瘤的進展［12］。動物實驗提示DNA低甲基化引起的染色體不穩(wěn)定性也是導致腫瘤發(fā)生的原因之一，這可能與逆轉座子LINE-1的去甲基化有關［13］。

DNA甲基化與頭頸部腫瘤相關易感因素的關系表觀遺傳信息受到基因組序列、環(huán)境暴露和隨機因素的影響，其中環(huán)境因素暴露已成為研究熱點。吸煙、長期酗酒、病毒感染是頭頸部腫瘤共同的易感因素，會導致DNA甲基化改變，促進腫瘤發(fā)生。

吸煙主要通過以下4個方面影響DNA甲基化：（1）破壞DNA結構。煙草中含有近60種致癌物，其中氮雜芳烴、亞硝胺、氨基甲酸乙酯、環(huán)氧乙烷等可導致DNA雙螺旋結構的破壞，在DNA的修復過程中招募的DNA甲基轉移酶1（DNA methyltransferase，DNMT1）對臨近 CpGs進行錯誤甲基化［14］；（2）尼古丁影響DNA甲基化水平。尼古丁激活cAMP相關信號通路的同時，也具有下調DNMT1表達水平的作用，從而改變基因組的甲基化［15］；（3）影響 DNA結合因子間接改變甲基化。吸煙可以上調細胞內刺激蛋白Sp1的表達，后者與富含CG的基因增強子模塊結合，從而阻止CpG島發(fā)生從頭甲基化［16］；（4）局部組織缺氧激活甲基化。吸煙會導致組織微環(huán)境的缺氧狀態(tài)，一方面激活HIF-1α依賴通路，促進合成甲基轉移酶，另一方面抑制TET蛋白活性［17］，從而影響DNA甲基化水平。

酗酒對DNA甲基化的影響主要與S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAMe）及一碳單位代謝通路（one-carbon metabolism）有關。一碳單位代謝的實質是將SAMe上的甲基化基團通過一系列反應轉移至DNA等其他化合物上，而酒精可以干擾其中多個酶的功能，從而導致DNA甲基化水平的改變。酒精可以抑制蛋氨酸腺苷轉移酶（methionine adenosyl transferase，MAT），從而減少SAMe生成，同時可以抑制DNMT，致使SAMe上的甲基基團無法進入循環(huán)；5-甲基四氫葉酸高半胱氨酸甲基轉移酶受到酒精抑制后，5-甲基四氫葉酸無法脫甲基為四氫葉酸，從而使碳單位循環(huán)受阻［18］。酗酒導致葉酸、維生素B12等營養(yǎng)物質吸收障礙［19］，一碳單位代謝受到抑制、DNA的不穩(wěn)定性增加并導致異常的甲基化狀態(tài)，從而促使腫瘤發(fā)生。

病毒感染在頭頸部腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視，其中以人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）和 EB 病 毒（Epstein-Barr virus，EBV）最為典型［20］。Zhao 等［21］報道頭頸部腫瘤中作為甲基化“清除器”的TET甲基化系數(shù)與HPV感染狀況存在相關性，研究認為EBV相關鼻咽癌患者中ITGA4、RERG和ZNF671基因的甲基化可以區(qū)分腫瘤與正常組織，其中的病毒作用機制仍未明確，病毒可能通過調節(jié)宿主細胞DNA甲基化來抵御抗病毒免疫，改變免疫微環(huán)境［22］。

與頭頸鱗癌相關的DNA甲基化位點頭頸鱗癌發(fā)病隱匿，常因不能早期診斷而延誤治療，基因甲基化為惡性腫瘤早期改變的特點之一，因此成為潛在的篩查生物標志。根據(jù)功能改變，基因位點可分為以下4類：（1）加快細胞周期促進增殖。RASSF1A是人類腫瘤中最常見的表觀修飾位點之一［23］，其失活可促進下游 microRNA 21 表達、細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）激活并消除p21和p27的抑制作用，從而促進細胞增殖［24］；細胞周期依賴性激酶抑制基因2A（CDKN2A）又稱為p16基因，通過pRb-E2F通路在G1-S轉換階段負性調節(jié)細胞周期進程，其甲基化改變將會導致腫瘤異常增殖［25］；甘丙肽受體 1（galanin receptor，GALR1）和p15、p21基因［26］的甲基化與細胞循環(huán)相關；（2）抑制細胞凋亡。死亡相關蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一種鈣相關調節(jié)因子，可以通過p19ARF/p53通路調節(jié)細胞凋亡，在包括頭頸部腫瘤在內的多種癌癥中存在異常甲基化［27］；速激肽1編碼P物質和神經(jīng)激肽A可以通過激活ERK1/2和 NF-κB 信號通路促進增殖和抗凋亡［28］；隔膜蛋白9、鈉碘轉運體蛋白8、染色體18上功能性smad抑制部分（FUSSEL18）、早期B細胞因子3及IRX1可通過影響轉化生長因子β（transforming growth factor β，TNFβ）干擾腫瘤凋亡［29］；（3）影響DNA修復。O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶（O6-methyguanine-DNA methytransferase，MGMT）是一種對烷化劑造成的DNA損傷敏感的DNA修復酶，其可在接受烷化劑類化療藥治療時保護正常細胞、防止二次癌變，但也會影響此類藥物對腫瘤的效果［30］。MGMT過甲基化導致表達下降與頭頸鱗癌有關，并具有雙向作用，一方面促進腫瘤發(fā)生侵襲轉移，同時也降低其對化療的耐藥性［31］；（4）促進遠處轉移。正常上皮細胞通過形成E鈣黏蛋白（E-cadherin）-β連蛋白（β-catenin）復合物與其他細胞及基底膜相黏附，而頭頸鱗癌中該位點的低表達與腫瘤局部侵襲及遠處轉移密切相關，可作為預后指標［32］；Ⅰ型膠原α2鏈是大部分組織連接處的纖維成分，其過甲基化同樣導致增殖和轉移增加［33］。

靶向DNA甲基化的治療方案與基因突變不同，DNA甲基化為可逆性改變，體外實驗證明逆轉過甲基化的DNA位點能使其重新獲得功能［34］。目前已有十余種抗甲基化藥物得到美國FDA批準或處于臨床實驗，按其作用機制可分為廣譜藥物和靶向藥物。DNMT抑制劑是經(jīng)典的廣譜抗甲基化藥物，可以造成廣泛去甲基化，從而逆轉腫瘤特異性改變［35］。阿扎胞苷（5-azacytidine）、地西他濱（5-aza-2'-deoxycytidine）等藥物抑制腫瘤的作用在臨床試驗中已得到驗證［34］。目前靶向DNA甲基化的藥物較少，IDH抑制劑AG-881、IDH305等可以穩(wěn)定三羧酸循環(huán)、干擾TET及組蛋白的異常甲基化，在急性髓細胞白血病中起到積極作用［36］。但去甲基化藥物的臨床應用也存在風險，廣泛去甲基化引起的基因不穩(wěn)定性可能會導致細胞凋亡，甚至促進成瘤基因的激活［37］。研究提示特異基因去甲基化可以改善化療藥物的耐藥性［38］，與化療、免疫治療等組成聯(lián)合方案是目前去甲基化治療的最佳方法。

結語DNA的異常甲基化（包括全基因序列的低甲基化和抑癌基因的高甲基化），在腫瘤發(fā)生中起到重要的作用。吸煙、長期酗酒、病毒感染被認為是頭頸部腫瘤的易感因素，可以通過多種途徑促進異常甲基化的發(fā)生，進而誘發(fā)正常組織癌變。目前針對 RASSF1A、CDKN2A、DAPK、MGMT、E-cadherin等位點的研究可能為完全揭示甲基化導致腫瘤發(fā)生的機制提供線索。液態(tài)活檢技術的應用以及對癌前病變甲基化的監(jiān)測可為腫瘤早期診斷提供便利。結合化療、免疫治療的甲基化靶向治療有望為改善患者預后作出貢獻。