改性核桃殼固定化脂肪酶研究

韓本勇　周志梅　耿樹香　馬婷　寧德魯　趙鵬　徐軍偉　余旭亞　李濤

摘要：以核桃殼為原料，采用磷酸活化法制備炭化核桃殼，接著通過表面氧化和硅烷化對(duì)其進(jìn)行改性處理使表面連接上疏水性有機(jī)官能團(tuán)，并以此為載體來固定化脂肪酶，研究了不同固定化條件對(duì)酶活力的影響以及固定化酶的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，最佳工藝條件為酶質(zhì)量濃度16 mg/mL，緩沖液pH值5.0，固定化時(shí)間3 h，固定化溫度30 ℃。在此條件下最高酶活力可達(dá)166 U/g，穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，固定化脂肪酶具有較好的熱穩(wěn)定性，而且反復(fù)使用10次后，固定化脂肪酶仍可保留60%以上的初始酶活。

關(guān)鍵詞：核桃殼;脂肪酶;固定化;載體;制備工藝;穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)： S188+.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）02-0282-05

收稿日期：2018-11-23

作者簡(jiǎn)介：韓本勇（1974—），男，云南昭通人，碩士，副教授，主要從事生物資源開發(fā)利用研究。E-mail：xmcx668@126.com。

通信作者：李 濤，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事生物資源開發(fā)利用研究。E-mail：1315385216@qq.com。

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一類廣泛用于催化甘油三酯水解的酶類。除了具有水解的功能外，還可以參與醇解、酯化、酯交換、內(nèi)酯合成、酯聚合及酰化反應(yīng)等，是研究和應(yīng)用最多的酶類之一[1-3]。但是游離脂肪酶存在諸多缺陷，例如受環(huán)境影響容易失活，催化過程不穩(wěn)定，反應(yīng)完成后與產(chǎn)品難分離或者分離成本高等缺陷，因而脂肪酶的進(jìn)一步應(yīng)用受到了限制，但是選擇適當(dāng)?shù)妮d體材料以及固定化方法，制備固定化脂肪酶，則可以有效避免采用游離脂肪酶帶來的問題[4-7]。

目前，已有多種材料被成功用于酶的固定化，來源廣泛、價(jià)格低廉的載體材料對(duì)于固定化酶的工業(yè)化應(yīng)用具有十分重要的影響。利用活性炭發(fā)達(dá)的孔系結(jié)構(gòu)、較好的機(jī)械強(qiáng)度，將其用于制備固定化酶已有不少研究[7-8]，結(jié)合脂肪酶結(jié)構(gòu)特性，將活性炭進(jìn)行疏水性改造，一方面利用活性炭較強(qiáng)的吸附能力，另一方面通過載體的疏水作用使脂肪酶的“蓋”打開[9]，并借助載體使這種活性構(gòu)象被固定住，從而有望提升催化活力。云南省是核桃大省，核桃殼資源十分豐富，本研究通過制備改性核桃殼載體，以此固定化脂肪酶，并進(jìn)行了相關(guān)工藝的優(yōu)化，以期為核桃殼的開發(fā)利用以及固定化脂肪酶的應(yīng)用提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃殼，由臨滄市云縣匯智源公司提供;脂肪酶，云南師范大學(xué)生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心饋贈(zèng);甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（KH-570）、橄欖油（西亞試劑）;考馬斯亮藍(lán)G250、牛血清蛋白（Sigma）;其他試劑均為分析純市售品。

1.2 儀器

高速多功能粉碎機(jī)（上海力箭機(jī)械有限公司）、馬弗爐（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）、臺(tái)式恒溫振蕩器（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）、pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多）、分光光度計(jì)（日本島津）、物理吸附儀（美國(guó)麥克）、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立）、紅外光譜儀（德國(guó)布魯克）、冷凍干燥機(jī)（美國(guó)SIM）。

1.3 方法

1.3.1 載體的制備 將核桃殼烘干、粉碎，加入一定量的磷酸溶液，在60 ℃水浴鍋中浸漬一段時(shí)間，過濾后將其送入馬弗爐，首先在300 ℃條件下炭化80 min，然后在600 ℃條件下活化80 min，活化結(jié)束后，取出用0.1%鹽酸清洗并用蒸餾水洗滌至中性[10]，最后烘干，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 載體的改性 載體的表面氧化：稱取5 g載體，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的硝酸溶液，在80 ℃的水浴鍋中浸漬3 h。過濾后將得到的濾餅置于燒杯中，加入蒸餾水煮沸、過濾，重復(fù)進(jìn)行4次后烘干[11]。

載體的表面硅烷化：取1 g氧化后的載體置于100 mL無水乙醇中，超聲分散1 h后形成均勻分散液;再加入一定量的0.01 mol/L HCl，調(diào)節(jié)溶液pH值至4.0，然后加入3%的KH-570溶液，在60 ℃的條件下反應(yīng)24 h，過濾，濾餅分別用無水乙醇和蒸餾水洗滌以除去未反應(yīng)的KH-570，烘干后即得固定化酶載體[12]。

1.3.3 固定化酶的制備 稱取1.0 g經(jīng)改性處理的載體于三角瓶中，加入5 mL含有一定量脂肪酶的緩沖液，在搖床上振蕩一定時(shí)間使載體吸附固定脂肪酶。固定完成后，移取一定量的溶液，離心取上清液，測(cè)定酶的吸附率。抽濾，用去離子水洗滌干凈，然后冷凍干燥，得到固定化脂肪酶，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩］d體制備及固定化原理如圖1所示。

1.3.4 固定化酶的穩(wěn)定性 熱穩(wěn)定性：將固定化酶和游離酶70 ℃水浴分別保溫0、1、2、3、4、5、6 h后取出，冷卻至室溫，再測(cè)定酶活。將保溫0 h時(shí)的酶活設(shè)定為100%。

重復(fù)使用性：取0.5 g固定化脂肪酶測(cè)定酶活力，測(cè)定完成后，取出，抽濾，洗滌，分離所得固定化酶，干燥后進(jìn)行下一次反應(yīng)。將初始酶活設(shè)定為100%。

1.3.5 脂肪酶含量及活力的測(cè)定 脂肪酶含量的測(cè)定以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量[13]。游離酶和固定化酶水解活力的測(cè)定均采用橄欖油水解法測(cè)定[14]，以在pH值為7的緩沖液、溫度為40 ℃的條件下，1 min水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量定義為1個(gè)活力單位（U）。

2 結(jié)果和討論

2.1 載體結(jié)構(gòu)的表征

2.1.1 傅立葉變換紅外吸收光譜儀（FT-IR）表征 載體改性前后的FT-IR譜如圖2所示。可以看出，樣品在3 200～3 500 cm-1處的強(qiáng)吸收峰是由醇、酚和有機(jī)酸的羥基（—OH）的伸縮振動(dòng)引起的，1 620 cm-1附近處的吸收峰對(duì)應(yīng)于CC或CO伸縮振動(dòng)，1 400 cm-1為活性炭表面上C—OH鍵變形振動(dòng)峰，1 125 cm-1對(duì)應(yīng)于仲醇中O—H或醇、酚中C—O或C—O—C的反對(duì)稱振動(dòng)。相比未改性載體，改性后載體在3 500 cm-1處的吸收峰比未改性的弱，說明一部分羥基與硅烷化試劑發(fā)生了反應(yīng)從而消耗了部分羥基[15]，同時(shí)改性載體在 1 074 cm-1 處出現(xiàn)Si—O基團(tuán)的伸縮振動(dòng)峰，進(jìn)一步說明硅烷化試劑已成功修飾到載體上[12]。

2.1.2 SEM結(jié)果 載體改性前后的SEM如圖3所示。可以發(fā)現(xiàn)，未改性載體以及改性載體的表面均非常粗糙，其上分布著大小不等的孔，并向里延伸。

經(jīng)過表面氧化以及硅烷化處理后，載體的孔結(jié)構(gòu)整體并未發(fā)生十分顯著的改變。

2.1.3 N2吸附-脫附分析結(jié)果 表1為改性前后載體的比表面積（BET）、孔體積和孔徑分布的情況。由表1可知，由核桃殼炭化制備的載體比表面積為803 m2/g，這可能是在制備過程中，未隔絕空氣處理，導(dǎo)致核桃殼部分氧化，開孔不夠充分，導(dǎo)致比表面積不夠高[16-17]，以及經(jīng)濃硝酸煮沸處理時(shí)，濃硝酸氧化導(dǎo)致活性炭的結(jié)構(gòu)塌陷，比表面積降低。經(jīng)改性處理后，載體的比表面積、孔體積均有所降低而孔徑基本不變。這是由于硅烷化使活性炭表面某些含氧基團(tuán)變?yōu)楹豕柰榛鶊F(tuán)，這些大的基團(tuán)以及有機(jī)硅化物的縮合產(chǎn)物在活性炭孔道表面對(duì)其進(jìn)行堵塞和填充，從而使比表面積和孔容減小，由于比表面積和比孔容同步減小，故平均孔徑?jīng)]有太大的變化，從比表面積、孔體積和孔徑分布的情況也進(jìn)一步說明疏水性的硅烷基團(tuán)已成功修飾到載體上。

2.2 固定化條件的優(yōu)化

2.2.1 酶液濃度對(duì)脂肪酶固定化的影響 從圖4可以看出，隨著酶液質(zhì)量濃度的增大，固定化脂肪酶的活力和蛋白吸附量也隨之增加，但當(dāng)酶液的質(zhì)量濃度達(dá)到16 mg/mL后，繼續(xù)增加酶液質(zhì)量濃度，固定化酶的活性和蛋白吸附量都不再上升且酶活略有下降。由于所用載體的孔徑小于脂肪酶分子的直徑[18]，因而脂肪酶不能進(jìn)入孔內(nèi)而只能吸附于外表面，在本試驗(yàn)中，當(dāng)載酶量達(dá)到1.8 mg/g時(shí)，根據(jù)王海雄等的試驗(yàn)結(jié)果[19]來估算，本試驗(yàn)范圍內(nèi)的吸附為多分子層吸附，這就增加了底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力，同時(shí)由于所用的脂肪酶為粗品，存在其他非酶成分，而使部分脂肪酶被包埋于內(nèi)部而不能與底物接觸，這些都使固定化酶的活力降低。高吸附量會(huì)由于酶分子緊密接觸而導(dǎo)致構(gòu)象變化以及增加空間傳質(zhì)阻力[20]。因此，在固定化酶的制備過程中，以酶溶液質(zhì)量濃度為16 mg/mL最佳。

2.2.2 緩沖液pH值對(duì)脂肪酶固定化的影響 由圖5可知，固定化脂肪酶的活力和蛋白吸附量隨著pH值的升高先升高而后降低。在pH值為5.0時(shí)，固定化脂肪酶活力達(dá)到最大，而游離酶的最適pH值為7，經(jīng)過固定化的脂肪酶的最適pH值下降，這可能是由于載體經(jīng)過改性處理后與脂肪酶的結(jié)合改變了其結(jié)構(gòu)，從而使其能適應(yīng)更低的pH值。Kandasamya等也發(fā)現(xiàn)，將脂肪酶固定在稻殼活性炭上后，在pH值為3.5的酸性環(huán)境下，脂肪酶活力更高[21]。因此，在固定化酶的制備過程中，以緩沖液pH值為5.0最佳。

2.2.3 固定化時(shí)間對(duì)脂肪酶固定化的影響 由圖6可知，隨著吸附時(shí)間的增加，固定化脂肪酶的活力和蛋白吸附量都不斷增大。當(dāng)吸附3 h時(shí)，固定化脂肪酶的活力和蛋白吸附量達(dá)到最大值，隨后隨著吸附時(shí)間的增加，固定化脂肪酶的活力和蛋白固定量不再增加，固定化酶活性甚至有所下降，這可能是由于脂肪酶和載體結(jié)合需要一段時(shí)間，而時(shí)間過長(zhǎng)，已經(jīng)固定上的酶有可能脫落下來或者由于脂肪酶分子相互聚集導(dǎo)致脂肪酶的活性中心互相遮蓋而影響酶活。因此，以改性核桃殼為載體的固定化脂肪酶最佳固定時(shí)間為3 h。

2.2.4 固定化溫度對(duì)脂肪酶固定化的影響 由圖7可知，在20～40 ℃范圍內(nèi)，蛋白吸附量隨溫度的升高而增大，固定化脂肪酶的活力先升高后降低。當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，固定化酶活力達(dá)到最大，之后固定化酶的活力迅速下降，這可能是脂肪酶的活性部位因溫度的升高而遭到破壞，導(dǎo)致酶失去部分活性。因此，以改性核桃殼為載體的固定化脂肪酶最佳固定溫度為30 ℃。

2.3 固定化酶的穩(wěn)定性

2.3.1 固定化酶的熱穩(wěn)定性 將固定化脂肪酶和游離酶緩沖溶液浸入60 ℃的水浴鍋中，每隔1 h取樣測(cè)其活力。由圖8可以看出，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，游離酶的相對(duì)活力迅速降低，下降速度遠(yuǎn)大于固定化酶，6 h后，相對(duì)活力趨近于零，幾乎完全失活。固定化酶在水浴時(shí)間小于2 h時(shí)，活力幾乎沒有下降，保溫6 h后，相對(duì)活力仍然保持在50%以上。可見脂肪酶經(jīng)固定化以后，熱穩(wěn)定性有了明顯提高，這主要是由于固定化過程增強(qiáng)了酶與載體之間的氫鍵、疏水相互作用及靜電相互作用，穩(wěn)定了酶分子構(gòu)象，從而減少了其熱致構(gòu)象變化的可能性，提高了酶分子的抗熱失活能力。

2.3.2 固定化酶的重復(fù)使用性 固定化脂肪酶的重復(fù)使用性對(duì)于它的應(yīng)用是非常重要的，將固定化酶重復(fù)用于橄欖油乳化液的水解反應(yīng)，測(cè)定其酶活力。由圖9可以看出，通過催化水解橄欖油來測(cè)定固定化酶的活力，在重復(fù)使用10次后，其相對(duì)酶活仍為原來的60%以上，表明固定化酶具有良好的重復(fù)使用性。

3 結(jié)論

以核桃殼為原料，通過改性處理制得疏水性載體，將其用于固定化脂肪酶，最適條件為酶質(zhì)量濃度 16 mg/mL，緩沖液pH值5.0，固定化時(shí)間3 h，固定化溫度30 ℃。在此條件下，固定化脂肪酶活力最大，酶活力達(dá)166 U/g。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，固定化脂肪酶具有較好的熱穩(wěn)定性，并且反復(fù)使用10次后，固定化脂肪酶的酶活力仍可達(dá)60%以上。表明制得的改性核桃殼是固定化脂肪酶的良好載體。

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