轉錄因子Nkx2.5、GATA4在先天性心臟病產前診斷中的研究

江敏　梁燕華　林麗虹

【摘要】 目的 研究轉錄因子Nkx2.5、GATA4在先天性心臟病（CHD）產前診斷中的臨床價值。方法 50例超聲心動圖確診胎兒為先天性心臟病的孕婦， 抽取孕婦羊水、臍血或引產胎兒臍血， 采用多重連接探針擴增技術（MLPA）檢測， 分析其染色體核型、 MLPA檢測結果。結果 50例先天性心臟病胎兒中6例染色體核型分析異常， 其中3例為21-三體綜合征， 2例為18-部分三體綜合征， 1例為46， XX，der（6） （q16q22）;剩余44例先天性心臟病胎兒染色體核型分析結果正常。50例先天性心臟病胎兒進行Nkx2.5、GATA4基因的突變篩查， 結果未發現任何突變。1例先天性心臟病患兒通過染色體微陣列分析（CMA）在染色體8p23.2位置檢出一段約859 kb的拷貝數變異（CNV）， 涉及OMIM基因CSMD1等， 可能為多態改變。結論 先天性心臟病胎兒不存在Nkx2.5、GATA4基因異常， 這可能一方面是由于所選樣本量過小， 有待于擴大樣本量， 以便進行更廣泛的篩查;另一方面也可能因為我國和國外的人種差異， 因此需進一步擴大先天性心臟病的樣本數量進行更深入的研究， 以進一步揭示先天性心臟病的發病機制。

【關鍵詞】 先天性心臟病;Nkx2.5;GATA4;產前診斷

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.04.091

先天性心臟病（congenital heart disease， CHD）近十年是我國出生缺陷的首位， 發病率在活產嬰兒占8‰～12‰。我國每年大約10萬～20萬先天性心臟病新生兒出生， 廣東省每年新增先天性心臟病新生兒至少7000例， 是我國城市0～5歲嬰幼兒死亡的首要原因[1-3]。其遺傳學病因有染色體病、單基因病、多基因病、線粒體病等。先天性心臟病的發病率占新生兒的0.4%～5.0%， 病因迄今仍不清楚。但研究認為， 先天性心臟病是由遺傳因素和環境因素共同作用導致心臟血管發育異常所引起的， 遺傳度為55%～65%， 并證實多種轉錄因子與心臟發育緊密相關， 包括GATA4、Nkx2.5、TBX5、AP2b等[4， 5]。本研究從分子水平觀察了先天性心臟病患者的Nkx2.5、GATA4基因突變情況， 初步探討兩種轉錄因子與先天性心臟病發病的關系， 為先天性心臟病的產前診斷和基因治療提供依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月～2017年12月本院超聲心動圖確診胎兒為先天性心臟病的孕婦50例， 包括心臟擴大、室間隔缺損（VSD）、房間隔缺損（ASD）、單心房、法洛四聯癥（TOF）、心內膜墊缺損、右心室雙出口、永存動脈干、大動脈轉位、主動脈弓狹窄、肺動脈狹窄、主肺動脈窗等， 經過遺傳咨詢自愿行介入性產前診斷。孕婦年齡20～44歲， 平均年齡（26.5±2.8）歲;孕周20+4～33周， 平均孕周（26.5±2.2）周。所有孕婦均簽署產前診斷知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標本提取 經知情同意抽取孕婦的羊水或臍帶血。妊娠18～24周孕婦：B超引導下經腹壁行羊膜穿刺抽取18～22 ml羊水， 使用2個無菌刻度離心管分裝， 離心后棄上清， 每管留下約2 ml的細胞懸液， 加入培養基7 ml， 使用2個細胞培養瓶分別接種， 置恒溫37℃， 5%CO2培養箱中， 培養9～10 d后換液， 細胞生長情況需要每天觀察， 貼壁細胞生長旺盛時可作為收獲節點， 出現較多透明圓形細胞時為明顯標志， 常規制片、G顯帶。妊娠25～37周孕婦：B超引導下經腹壁行臍血細胞穿刺術， 循常規操作染色體制片， 在1640培養基中注入1 ml肝素鈉抗凝的血標本以行淋巴細胞培養， 大約60～75 h后即可收獲， 取常規G顯帶（400條帶）制成所需染色體片。每例計數35個以上核型， 并對5～7個核型進行分析， 發現異常者可增加至17個核型分析。

1.2.2 DNA提取方法 ①羊水DNA提取：取5 ml羊水， 3000 r/min離心10 min， 棄上清， 用1 ml生理鹽水漂洗2次， 12000 r/min離心5 min， 棄上清。根據基因組DNA提取試劑盒說明書抽提羊水基因組DNA， 并計算DNA的濃度。②臍帶血DNA提取：取胎兒臍帶血1～2 ml（EDTA抗凝）， 全基因組DNA可采用酚-氯仿法提取， DNA在260 nm和280 nm處的吸光值需用分光光度計法測定并提取， 從而得出濃度及純度值， 并用TE溶液稀釋終濃度至50 ng/?l。

1.2.3 MLPA檢測方法 采用荷蘭MRC-Holland公司生產的P311試劑盒， 包含了檢測GATA4所有7個外顯子及GATA4基因上下游序列、Nkx2.5基因所有2個外顯子的探針。按MLPA試劑盒所提供的操作流程進行探針的雜交和擴增。檢測擴增產物需在ABI3500遺傳分析儀（Applied Biosystems）上進行， 并通過Genemapper3.7獲取結果， 最后通過Coffalyser v9.4（MRC-Holland）進行分析得出基因相對拷貝數比值。

1.3 統計學方法 所得結果通過GenemarkerV 1.80 軟件進行定量分析， 將獲得的擴增產物峰的峰面積進行標準化， 并得到反映樣本DNA片段擴增數目變化的比值， 以便于分析DNA片段變化的情況。

2 結果

2.1 染色體核型結果 50例先天性心臟病胎兒中6例染色體核型分析異常， 其中3例為21-三體綜合征， 2例為18-部分三體綜合征， 1例為46， XX， der（6） （q16q22）;剩余44例先天性心臟病胎兒染色體核型分析結果正常。

2.2 MLPA結果 50例先天性心臟病胎兒進行Nkx2.5、GATA4基因的突變篩查， 結果未發現任何突變。1例先天性心臟病患兒通過染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis， CMA）在染色體8p23.2位置檢出一段約859 kb的拷貝數變異， 涉及OMIM基因CSMD1等， 可能為多態改變。

3 討論

先天性心臟病簡稱先心病， 是胎兒期心血管發育異常引起的血管畸形， 也是最為常見的血管畸形之一， 其發病率占出生活產嬰兒的比例很高， 是新生兒致死致殘的一個主要原因。先天性心臟病的發病機制復雜， 臨床表現明顯不同， 可能與遺傳、宮內感染、大劑量放射性物質接觸和藥物等因素有關[6]。一些患兒癥狀明顯， 一般在 0～15 歲的幼兒期即可發現;一些患兒可能無明顯癥狀， 直至出現癥狀時才發現其患有先天性心臟病。根據先天性心臟病的嚴重程度， 外科修補或內科封堵手術都能有效的控制先天性心臟病。由于遺傳基因突變導致的先天性心臟病， 即使做了心臟修補手術也可能出現一些其他的并發癥， 如心律失常、心內膜炎和心力衰竭， 因此還需要注意觀察， 有可能還需要額外的外科手術。值得一提的是， 先天性心臟病中的心臟傳導系統異常是可以伴隨患者終生的十分危險的致死病因， 且癥狀會隨著年齡增加而呈現逐漸加重的趨勢。因此， 對先天性心臟病患者進行遺傳基因檢測， 找出致病基因， 對患者術后的生活質量和生存率都至關重要。近期心臟發育中的一些轉錄調控回路的研究也發現心臟轉錄因子在先天性心臟病發生發展中也起著重要作用， 如轉錄因子 Nkx2.5、GATA4 和 TBX5 在心臟的早期發育中就都起著重要作用[7， 8]。因此， 本文旨在討論心臟轉錄因子 Nkx2.5和GATA4在早期產前診斷中對心臟產生的重要作用及其突變導致的先天性心臟病表型， 并討論其導致先天性心臟病的可能機制。

人類在胚胎期的心血管系統是在第3周開始發育的， 直到第8周結束。心臟發育起始于前面側板中胚層內心臟祖細胞的分化。心臟的胚胎發育可分為分段發育、融合連接、扭曲旋轉和順序分隔4步。人類胚胎發育到第16～17天， 血管母細胞增殖形成鼓勵的內皮細胞團;到第18～19天， 生心板形成;胚胎發育到第23天， 單個心管形成， 開始低效率的收縮;第26天， 單個心房心臟形成;第29天， 開始發育成兩個心房;第30天血液循環系統開始運行， 第49天心臟四個腔室基本形成， 但要到出生才會發育為成熟的心臟。其中主要的發育包括心管的形成、心臟的扭轉、心臟的環化、房室分隔、傳導系統和血管的發育以及流出通道的形成。

研究表明[9]， Nkx2.5是心臟前體細胞分化的最早期標志之一， 參與心臟前體細胞分化、房室分隔、房室流出道的形成和傳導系統的成熟;在發育成熟的心臟中， Nkx2.5表達局限在房室肌細胞中， 但對成熟心臟發揮正常功能卻不可缺少。人類Nkx2.5基因定位于染色體5q34上， 有2個外顯子， 編碼324個氨基酸， 在進化上高度保守。其突變與多種先天性心臟病的形成有關， 如房間隔缺損、室間隔缺損、法洛四聯癥和伴有傳導系統病變的三尖瓣下移畸形。有研究表明[10]， 幾乎所有類型的先天性心臟病都存在Nkx2.5基因的突變， 國外已經發現41種突變報道， 其中33種單核苷酸置換， 6種核苷酸缺失， 2種核苷酸插入。McElhinney等[11] 報道NK2.5基因外顯子1的突變存在于各種先天性心臟病中， 但國內卻少有發現報道。2005年， 石琳等[12]對包括室間隔缺損、法樂四聯癥、房間隔缺損、完全性肺靜脈畸形引流、完全性大動脈轉位在內的110例中國先天性心臟病患兒及110例正常對照者的NK2.5基因外顯子1及其側翼進行突變檢測， 結果任何突變位點都未被發現， 但是發現了1個新的SNP位點63A>G（rs2277923）。對其基因型和等位基因頻率變化的分析發現， 對照組和病例組都顯示G基因型高于基因庫中所標示的基因型A， 對照組中G基因型達到了62%， 而病例組中的室間隔缺損和法樂四聯癥組中G基因型則均達到了87%， 該SNP在兩組病例與對照組之間明顯存在著顯著的相關性。韓增強等[13]對81例單純性先天性心臟病患者的研究發現， Nkx2.5基因突變與我國單純性先天性心臟病之間無明顯相關。國內簡永遠等[14]對30名廣西壯族ASD患者及30例廣西壯族對照病例進行Nkx2.5基因的突變篩查中， 結果并未發現任何突變。關于散發先天性心臟病人群的突變研究， 張為民等[15]篩查了120例維吾爾族ASD患者， 也并未檢測出任何Nkx2.5基因突變。

GATA4基因定位于8p23.1-p22， 是心臟發生調節網絡中重要的蛋白， 是在心臟早期發育中起關鍵作用的轉錄因子之一， 并且相互作用于其他轉錄調節因子， 是心臟細胞胚胎發育過程中的早期標志， 并調控心肌細胞的分化增生及心臟的形態發生過程[16-18]。首先在心前期中胚層表達， 隨后在心內膜與心肌中表達， 并參與調節表達心臟結構基因， 主要包括心臟肌球蛋A重鏈-α（α-Myhc）、心肌鈣蛋白C、心房利鈉肽因子（ANF）等， 也通過其鋅指結構與其他心臟特異性的轉錄因子（如Nkx2.5、TBX5等）相互作用共同發揮轉錄調控作用[19-21]。該基因單個或多個突變及異常表達均會導致心臟結構畸形， 如室間隔缺損、房間隔缺損、房室間隔缺損、心內膜墊缺失、右心室雙流出道、左心發育不全綜合征、肺動脈縮窄、動脈導管未閉等。自2003年Garg等首次證實轉錄因子GATA4突變是導致人類先天性心臟病的致病原因之一。隨后有多個研究報道GATA4突變與人類先天性心臟病相關[17， 18， 20]。汪希珂等[16]對198例先天性心臟病患者研究發現2例GATA4位點雜合突變。

本研究未發現先天性心臟病胎兒存在Nkx2.5、GATA4基因異常， 這可能一方面是由于所選樣本量過小， 因此有待于擴大樣本量， 以便進行更廣泛的篩查;另一方面也可能因為我國和國外的人種差異。同種疾病可能有不同類型的基因突變， 即由遺傳的異質性決定， 可能Nkx2.5、GATA4基因并非是我國先天性心臟病的主效基因。同時進一步提示先天性心臟病有著復雜的發病機制， 并提示可能的多基因相互作用、可能的環境一遺傳因素的相互作用， 需進一步擴大先天性心臟病的樣本數量進行更深入的研究， 以進一步揭示先天性心臟病的發病機制。

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[收稿日期：2019-12-10]