地黃飲子對D-半乳糖衰老模型大鼠學習記憶能力及衰老相關蛋白P16、P21的影響

蔡智剛　唐新征

【摘要】 目的 通過探討地黃飲子對衰老大鼠學習記憶能力及衰老相關蛋白P16、P21的影響， 研究地黃飲子對于延緩衰老的作用。方法 50只SD大鼠， 隨機分為正常組、衰老組、地黃飲子組、六味地黃丸組、維生素E組， 每組10只。除正常組外， 每組頸背部皮下注射D-半乳糖380 mg/kg， 連續3個月。同時地黃飲子組、六味地黃丸組、維生素E組分別給予地黃飲子、六味地黃丸、維生素E灌胃。用Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力， 用Western blot檢測大鼠海馬中P16、P21蛋白的表達。比較五組大鼠到達平臺時間、經過平臺次數;海馬中P16、P21蛋白表達水平。結果 衰老組大鼠經過平臺次數為（2.21±1.56）次低于正常組的（6.43±1.21）次， 到達平臺時間為（75.33±4.22）s長于對照組的（36.68±4.10）s， 差異具有統計學意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠到達平臺時間（45.92±3.84）s短于衰老組的（75.33±4.22）s、維生素E組的（58.23±3.69）s， 經過平臺次數（6.82±1.22）次高于衰老組的（2.21±1.56）次、維生素E組的（5.09±1.61）次， 差異具有統計學意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠到達平臺時間、經過平臺次數與六味地黃丸組比較差異無統計學意義（P>0.05）。衰老組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達水平分別為（0.44±0.01）、（0.49±0.02）ng/ml高于正常組的（0.32±0.01）、（0.25±0.02）ng/ml， 差異具有統計學意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達水平低于衰老組、六味地黃丸組、維生素E組， 差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 地黃飲子方能夠提高衰老大鼠的學習記憶能力， 通過降低大鼠體內P16、P21的含量從而達到延緩衰老的目的。

【關鍵詞】 地黃飲子;衰老;P16;P21

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.04.090

中國正快速步入老齡化社會， 衰老和死亡是任何物種的個體都難以避免的最終結局， 但至今對衰老發生機制的理解還相當有限。鑒于其重要性， 衰老一直是生物學研究的熱點。如何發揮中醫中藥的優勢， 采用中西醫結合的方法， 優勢互補， 最大程度的提高老年人的生活質量， 延緩老年人臟器的衰老， 防治重大老年性疾病， 成為亟待解決的重大問題。本研究通過觀察地黃飲子對實驗室衰老后SD大鼠日常生活能力及衰老蛋白P16、P21的表達高低， 探討以地黃飲子為代表的補腎法對延緩衰老的意義。現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 50只8周齡SD雄性大鼠， 體重（225±12）g，?廣州中醫藥大學附屬第一醫院提供合格實驗動物， 動物許可證：SYYK（粵）2018-0012。飼養環境溫度約22℃， 濕度55%～65%， 飲用水為純凈水。處置動物嚴格遵守實驗動物倫理學標準[1]。將50只SD大鼠隨機分為正常組、衰老組、地黃飲子組、六味地黃丸組、維生素E組， 每組10只。

1. 2 藥物 地黃飲子藥物組成：均為道地藥材， 其中菟絲子15 g、山萸肉20 g、牛膝10 g、鹿角膠15 g、龜板膠10 g、熟地黃30 g、淮山15 g、枸杞15 g（由廣州中醫藥大學深圳醫院煎制）。其中除龜板膠、鹿角膠烊化外， 將其他所有藥物混合煎煮， 待藥物有效成分析出外， 濃縮， 置于冰箱保存。

1. 3 實驗試劑及主要儀器

1. 3. 1 主要試劑 Western blot主要試劑：來自Santa公司的P21多克隆抗體、P16單克隆抗體;來自Amresco公司的D-半乳糖、其他原料均來自廣州中醫藥大學實驗室已有原料。

1. 3. 2 主要儀器 水平搖床、凝膠電泳儀、核酸蛋白測定儀、大鼠水迷宮實驗裝置等設備。

1. 4 方法

1. 4. 1 模型的制備 制備衰老大鼠動物模型參照相關文獻[2， 3]：除正常組外， 每組頸背部皮下注射D-半乳糖380 mg/kg，?連續3個月。同時地黃飲子組、六味地黃丸組、維生素E組分別給予地黃飲子、六味地黃丸、維生素E灌胃。喂養到期后將大鼠處死， 分離海馬， 放組織液中保存。

1. 4. 2 大鼠學習記憶能力檢測 測試方法水迷宮水池的設置、定位航行實驗參照有關文獻[5]。

1. 4. 3 P16、P21蛋白檢測 采用Western blot免疫印跡法檢測P16、P21蛋白， 參照自身實驗室Western blot步驟及查閱相關文獻[6]。

1. 5 觀察指標 比較五組大鼠到達平臺時間、經過平臺次數;海馬中P16、P21蛋白表達水平。

1. 6 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

實驗過程中出現大鼠的非正常死亡例數：正常組0例， 衰老組1例， 地黃飲子組1例， 六味地黃丸組2例， 維生素E組0例。

2. 1 五組大鼠到達平臺時間、經過平臺次數比較 衰老組大鼠經過平臺次數低于A組正常組， 到達平臺時間長于對照組， 差異具有統計學意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠到達平臺時間短于衰老組、維生素E組， 經過平臺次數高于衰老組、維生素E組， 差異具有統計學意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠到達平臺時間、經過平臺次數與六味地黃丸組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2. 2 五組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達水平比較 衰老組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達水平高于正常組， 差異具有統計學意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達水平低于衰老組、六味地黃丸組、維生素E組， 差異具有統計學意義（P<0.05）。見表2， 圖1， 圖2。

3 討論

衰老是人類正常生命活動的自然規律， 人類的機體在生長發育完成之后， 便逐漸進入衰老的過程。探討衰老的概念、原因和衰老時的生理、病理改變， 以至防止衰老的措施， 是十分重要的。

衰老可分為兩類， 即生理性衰老及病理性衰老。生理性衰老系指隨年齡的增長到成熟期以后所出現的生理性退化， 也就是人體在體質方面的年齡變化， 這是一切生物的普遍規律。病理性衰老即由于內在的或外在的原因使人體發生病理性變化， 使衰老現象提前發生， 這種衰老又稱為早衰。

腎為先天之本， 人的生長發育衰老與腎臟的關系極為密切。《素問·上古天真論》中“女子七七”、“丈夫八八”的一段論述， 即是以腎氣的自然盛衰規律， 來說明人體生長、發育、衰老的過程與先天稟賦的關系， 從而提示衰老的關鍵在于腎氣的盛衰。腎屬水， 主藏精， 為元氣之本， 一身陰陽生化之根。腎的盛衰影響著元氣的盛衰和生化功能的強弱， 腎虛則元氣衰， 元氣衰則生化功能弱， 人的衰老就會加速到來。

人的生命活動， 靠臟腑氣血充盛、功能協調來維持。腎為先天之本， 對人的生長、發育、衰老起著決定性的作用。腎氣虛損， 五臟六腑功能減退， 則出現一系列衰老征象， 這是人類變老的重要原因。腎氣充盛即能抗病又能抗衰老延年益壽。中醫學在抗衰老理論上， 補腎法延緩衰老具有重要的臨床意義。本研究中地黃飲子方用熟地黃、山茱萸滋補腎陰， 肉蓯蓉、巴戟天溫壯腎陽， 四味共為君藥。配伍附子、肉桂之辛熱， 以助溫養下元， 攝納浮陽， 引火歸原;石斛、麥冬、五味子滋養肺腎， 金水相生， 壯水以濟火， 均為臣藥。石菖蒲與遠志、茯苓合用， 是開竅化痰， 交通心腎的常用組合， 是為佐藥。姜、棗和中調藥， 功兼佐使。

細胞的衰老是機體衰老最重要的因素之一， 對于衰老機制的研究也在不斷深化 [9-11]。本研究觀察補腎生髓方劑地黃飲子對衰老大鼠的干預， 結果顯示：衰老組大鼠經過平臺次數低于A組正常組， 到達平臺時間長于對照組， 差異具有統計學意義（P<0.05）， 提示制造衰老模型后明顯降低了大鼠的日常生活能力。地黃飲子組大鼠到達平臺時間短于衰老組、維生素E組， 經過平臺次數高于衰老組、維生素E組， 差異具有統計學意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠到達平臺時間、經過平臺次數與六味地黃丸組比較差異無統計學意義（P>0.05），?提示地黃飲子一方面能提高大鼠經過平臺的次數， 同時到達平臺的潛伏期也明顯縮短， 說明地黃飲子能提高大鼠學習、記憶能力。衰老組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達水平高于正常組， 差異具有統計學意義（P<0.05）， 說明衰老大鼠中P16、P21蛋白表達增高。地黃飲子組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達水平低于衰老組、六味地黃丸組、維生素E組， 差異具有統計學意義（P<0.05）。得出補腎生髓中藥可以明顯延緩機體衰老， 補腎生髓法能夠提高大鼠學習記憶能力， 并能夠明顯下調P16、P21的表達水平來達到延緩衰老的目的。證明 “腎主骨生髓” 中醫理論在延緩衰老機制中的正確性和可操作性。

綜上所述， 遵循“腎-精-髓-腦”理論， 采用補腎生髓中藥地黃飲子對延緩機體衰老是有希望的， 在中醫理論指導下的實驗研究， 不僅為延緩衰老提供了研究的新思路和新方案， 而且有利于醫學的進步和發展， 開拓新的治療方法。

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[收稿日期：2019-05-20]