銅綠假單胞菌重組Bb（pGEX?OprF?I）疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)力及體液免疫應(yīng)答

梁誠誠 李文桂

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所（重慶400016）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是 一種常見的Gram陰性致病菌，具有基因組多樣性和多環(huán)境持續(xù)存在的特點(diǎn)，可引起廣泛的院內(nèi)感染，如呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、敗血癥、尿路感染和器械相關(guān)性感染［1-3］。Pa還影響宿主的損傷修復(fù)機(jī)制，使細(xì)菌更易定植和更難清除，從而發(fā)展為遷延不愈的慢性感染，增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于Pa生物膜形成、β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生和抗生素濫用等內(nèi)在和獲得性的抗性機(jī)制［4-5］，使得耐藥菌株增多，世界衛(wèi)生組織已將其歸類為耐藥的優(yōu)先病原體，抗菌治療愈發(fā)艱難［6-7］。單一的抗生素化療往往不能解決問題，疫苗研制是有效的替代手段之一。

目前Pa疫苗的種類繁多，如外膜蛋白疫苗、脂多糖疫苗、鞭毛疫苗和菌毛疫苗等，但這些疫苗仍存在安全性或有效性等問題，因此，有必要研究新型疫苗［8］。外膜蛋白F-I（outer membrane protein F?I，OprF?I）是一種具有開發(fā)前景的疫苗分子［9］。RELLO等［10］將重組蛋白OprF?I免疫機(jī)械通氣的ICU患者，在初免后14 d發(fā)現(xiàn)血清IgG抗體升高，侵襲性感染率減低，提示該蛋白具有良好的免疫原性。兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum，Bb）具有益生菌和穩(wěn)定表達(dá)外源抗原的作用，使其成為一種新型疫苗載體［11］。本研究在成功構(gòu)建重組Bb（pGEX?OprF?I）疫苗的基礎(chǔ)上［12］，將其免疫小鼠，觀察其誘導(dǎo)的保護(hù)力及體液免疫應(yīng)答，從而為研究其保護(hù)性免疫機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 銅綠假單胞菌重組Bb（pGEX?OprF?I）疫苗由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究構(gòu)建及保存，見文獻(xiàn)［12］；21只6～8周齡清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA購自美國Southern Biotech公司；Pa抗原及感染的鼠血清由本研究所保存；LB（Luria?Ber?tani，LB）培養(yǎng)基和MRS（Man?Rogosa?Sharpe，MRS）固體和液體培養(yǎng)基由本研究所制備。酶標(biāo)儀購自Scientific Thermo公司。本研究通過重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，整個(gè)研究過程符合倫理學(xué)要求（倫理批準(zhǔn)號(hào)：2018015）。

1.2 動(dòng)物免疫及攻擊方案 將21只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組：疫苗組［rBb（pGEX?OprF?I）］、空載體對(duì)照組［rBb（pGEX?1λT）］和Bb對(duì)照組，每組7只，均口采用服灌胃免疫途徑。將5×108CFU疫苗重懸于100μL的MRS培養(yǎng)液，每日接種1次，每周連續(xù)3 d，共3周。在初次接種后4周，將5×107CFU PA01株重懸于10μL的LB培養(yǎng)液，進(jìn)行1次性滴鼻攻擊。

1.3 肺細(xì)菌負(fù)荷計(jì)數(shù) 在攻擊感染后2周處死小鼠，無菌取1 g肺組織，勻漿稀釋涂皿，37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)肺細(xì)菌菌落。

1.4 常規(guī)ELISA檢測(cè)小鼠血清IgG及其亞類、IgE和IgA抗體水平 分別在接種前和初免后4周采集小鼠尾靜脈血，PA01株攻擊后2周摘除眼球取血，分離血清后-20℃凍存待查。常規(guī)ELISA法檢測(cè)IgG及其亞類、IgE和IgA抗體。以1μg/孔Pa抗原包被96孔酶標(biāo)板（4℃過夜），封閉2 h后，先后加入小鼠血清（1∶100稀釋）和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA（1∶5 000稀釋），反應(yīng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀檢測(cè)血清A492 nm值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，肺細(xì)菌計(jì)數(shù)用（Ig CFU/g）表示，多組間比較用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺細(xì)菌的菌落計(jì)數(shù) 疫苗免疫及PA01株攻擊后，小鼠的肺細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示疫苗組、空載體對(duì)照組和Bb對(duì)照組的菌落數(shù)分別為（7.43±0.03）Ig CFU/g、（8.86±0.05）Ig CFU/g和（8.87±0.05）Ig CFU/g。疫苗組的肺細(xì)菌菌落數(shù)明顯低于其余兩個(gè)對(duì)照組（F=2 476.634，P＜0.001），空載體對(duì)照組和Bb對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.016，P=0.878，表1）。

表1 疫苗免疫及PA01株攻擊后小鼠的肺細(xì)菌菌落數(shù)Tab.1 The number of bacteria colonies in the lung of mice immunized with rBb（pGEX?OprF?I）vaccine and challenged with PA01 strain ±s

表1 疫苗免疫及PA01株攻擊后小鼠的肺細(xì)菌菌落數(shù)Tab.1 The number of bacteria colonies in the lung of mice immunized with rBb（pGEX?OprF?I）vaccine and challenged with PA01 strain ±s

注：與空載體和Bb對(duì)照組比較，*P<0.01

組別疫苗組空載體對(duì)照組Bb對(duì)照組例數(shù)7 7 7肺細(xì)菌的菌落數(shù)（Ig CFU/g）7.43±0.03*8.86±0.05 8.87±0.05

2.2 免疫鼠血清IgG及其亞類、IgE和IgA的抗體水平 用常規(guī)ELISA法檢測(cè)小鼠免疫前、初免后4周和攻擊后2周的血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平變化情況。結(jié)果如圖1（A、B、C、D、E）所示，同一時(shí)間點(diǎn)的不同組間比較，接種前的血清IgG及其亞類水平較低，且在3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（IgG：F=0.310，P=0.738；IgG1：F=0.942，P=0.408；IgG2a：F=0.716，P=0.502；IgG2b：F=0.398，P=0.677；IgG3：F=0.112，P=0.895）；初免后4周和攻擊后2周的疫苗組血清IgG及其亞類水平較空載體對(duì)照組和Bb對(duì)照組均明顯增高（初免后4周和攻擊后2周的F值分別為：IgG：F1=100.551，F(xiàn)2=57.536；IgG1：F1=45.063，F(xiàn)2=51.186；IgG2a：F1=91.861，F(xiàn)2=122.183；IgG2b：F1=233.236，F(xiàn)2=306.465；IgG3：F1=97.414，F(xiàn)2=293.089，均P＜0.001）；不同時(shí)間點(diǎn)的同組間比較，與免疫前相比，初免后4周的疫苗組血清IgG及其亞類均顯著升高，在攻擊后2周達(dá)更高水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（IgG：F=306.807；IgG1：F=99.553；IgG2a：F=206.512；IgG2b：F=1 585.056；IgG3：F=468.935，均P＜0.001）。而IgE和IgA在3組的所有時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)出。

圖1 疫苗免疫及PA01株攻擊后小鼠血清IgG及其亞類抗體的水平變化Fig.1 Observation of sera IgG and IgG isotype distribution in mice immunied with rBb（pGEX?OprF?I）vaccine and challenged with PA01 strain

3 討論

檢測(cè)肺細(xì)菌負(fù)荷是評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)力的關(guān)鍵指標(biāo)。既往研究［15-16］表明，銅綠假單胞菌OprF或OprI蛋白疫苗可有效降低免疫小鼠的肺細(xì)菌負(fù)荷，增強(qiáng)清除Pa感染的能力。SAHA等［13］發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pGACAG?OprF?I肌肉注射免疫的小鼠可抵抗銅綠假單胞菌D4株的鼻內(nèi)攻擊，其肺組織和血清中的肺細(xì)菌菌落數(shù)明顯下降，存活率提高，顯示出一定的保護(hù)作用。本研究顯示rBb疫苗灌胃免疫及PA01株攻擊小鼠后，肺細(xì)菌菌落數(shù)明顯降低，與上述結(jié)果相似，表明該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較好的保護(hù)力。

體液免疫是機(jī)體抵抗病原體的重要機(jī)制之一，抗體檢測(cè)是評(píng)價(jià)其體液免疫的主要指標(biāo)。高水平的IgG抗體在急性肺部感染大鼠模型中顯示出較好的抗Pa感染的作用。LEE等［14］發(fā)現(xiàn)抗銅綠假單胞菌外膜蛋白IgG對(duì)其各型菌株具有交叉保護(hù)作用，并能激活吞噬細(xì)胞發(fā)揮調(diào)理吞噬作用。ZHANG等［15］將重組沙門氏菌的OprF?I融合蛋白疫苗以不同途徑接種小鼠，初免后6周免疫小鼠血清和肺組織中的IgG抗體均升高，但口服灌胃組的抗體水平明顯低于其他免疫組。本研究將rBb疫苗灌胃免疫及PA01株攻擊小鼠后，初免后4周的免疫鼠血清IgG抗體較接種前和相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組明顯升高，顯著高于重組沙門氏菌誘導(dǎo)的抗體水平，推測(cè)Bb是一種良好的疫苗載體，能將目的蛋白有效傳遞到腸道免疫系統(tǒng)，在抗原提呈細(xì)胞和Th細(xì)胞輔助下刺激漿細(xì)胞合成和分泌抗體，通過再循環(huán)途徑使血清IgG升高，激發(fā)更強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，且口服灌胃是該載體疫苗較好的免疫途徑。IgG能與Pa的抗原分子結(jié)合發(fā)揮中和作用；與中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合，促進(jìn)其吞噬病原體；通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，C3b和C4b等調(diào)理素可固定細(xì)菌，輔助IgG的調(diào)理作用；與NK細(xì)胞等殺傷細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，活化的NK細(xì)胞可釋放穿孔素、絲氨酸蛋白酶等細(xì)胞毒物質(zhì)殺傷Pa。

IgG亞類在保護(hù)性免疫機(jī)制中具有重要作用，其中IgG2a和IgG1是Th1和Th2型免疫應(yīng)答的標(biāo)志性抗體。在銅綠假單胞菌慢性感染的早期，IgG亞類抗體水平顯著增加。WEIMER等［16］將重組OprF?I融合蛋白肌肉注射免疫小鼠，血清抗體檢測(cè)顯示免疫小鼠可誘導(dǎo)高水平的IgG2a和IgG1，類似結(jié)果也出現(xiàn)在過往文獻(xiàn)［20］中。本研究顯示銅綠假單胞菌重組Bb（pGEX?OprF?I）疫苗免疫的小鼠在初免后4周血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3明顯升高，表明其可能參與疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答，該疫苗表達(dá)的抗原可刺激CD4+T細(xì)胞增殖分化為輔助性Th細(xì)胞，Th1和Th2細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，從而促進(jìn)IgG亞類的合成和分泌。與上述研究比較，由于Bb存在佐劑效應(yīng)，Bb介導(dǎo)的融合蛋白疫苗可較單純?nèi)诤系鞍滓呙缫鸶鼮楦咝У谋Ｗo(hù)性體液免疫應(yīng)答。這些IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3亞類可激活補(bǔ)體、結(jié)合巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞表面的Fc受體，發(fā)揮調(diào)理和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，從而殺傷Pa。

記憶性B細(xì)胞可給機(jī)體提供長(zhǎng)期且穩(wěn)定的體液免疫記憶，與疫苗的免疫效果密切相關(guān)［17］。BEHROUZ等［18］將二價(jià)鞭毛蛋白滴鼻免疫小鼠，PAK或PA01株攻擊后發(fā)現(xiàn)小鼠血清IgG及其亞類明顯升高，抗Pa感染的能力增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)rBb疫苗免疫及PA01株攻擊后2周的免疫小鼠血清IgG及其亞類較初免后4周顯著升高，表明該疫苗可刺激宿主產(chǎn)生較好的免疫記憶，當(dāng)機(jī)體再次接觸相同抗原時(shí)，記憶性B細(xì)胞可活化增殖并分化為漿細(xì)胞，使抗體滴度迅速升高，產(chǎn)生更強(qiáng)、更持久的體液免疫應(yīng)答。

綜上，OprF?I融合蛋白是具有良好免疫原性的疫苗分子，以Bb為載體介導(dǎo)的OprF?I融合蛋白疫苗顯示出安全無毒、接種方便和產(chǎn)生較強(qiáng)保護(hù)力及體液免疫應(yīng)答的優(yōu)點(diǎn)，為Pa疫苗的研制提供新的思路。本研究的不足之處在于只觀察了疫苗的免疫力和抗體水平，疫苗對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果還有待進(jìn)一步觀察，如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活時(shí)間、組織切片以及體內(nèi)細(xì)胞因子變化等，后續(xù)也將對(duì)疫苗的保護(hù)性免疫機(jī)制進(jìn)行深入探討，此外還將探索疫苗接種的最佳劑量、途徑以及增強(qiáng)疫苗免疫效果的佐劑分子等諸多問題。