血清miR?191?5p和miR?20a?5p聯合作為腦卒中后認知功能障礙診斷標志物的研究

王振杰 谷詩濃 劉毓佳 周凡萍 黃賽娥

1福建中醫藥大學（福州350122）；2福建中醫藥大學附屬康復醫院（福州350003）；3福建省康復技術重點實驗室（福州350003）；4武漢科技大學附屬孝感市中心醫院（武漢432000）

腦卒中后認知障礙（post?stroke cognitive im?pairment，PSCI）是指急性腦血管病導致的各種類型和不同程度的認知功能減退，是血管性認知障礙的重要組成部分［1-2］。microRNAs（miRNAs）是一種單鏈非編碼含有20～24個核苷酸的小分子RNA，通過與信使RNA（mRNA）的3‘UTR或5′UTR結合，促進或抑制mRNAs的翻譯，從而達到對機體功能的調節［3-4］。研究［5-7］表明，miR?191?5p和miR?20a?5p都與改善腦卒中后缺氧狀態下神經元細胞死亡，促進神經元突觸可塑性形成，緩解認知障礙相關。因此，血清miR?191?5p和miR?20a?5p具備成為診斷PSCI的生物標記物的潛能。綜上所述，本研究主要目的是探討miR?191?5p聯合miR?20a?5p對于PSCI患者的診斷價值，分析臨床意義。

1 資料與方法

1.1 受試者及納排標準 2017年10月至2018年4月從福建中醫藥大學附屬康復醫院招募了72例卒中患者和37例年齡匹配對照（age?matched control，AMC）受試者。卒中患者和對照者的年齡，性別和受教育程度相匹配。所有受試者年齡在45歲至75歲之間，本研究已經通過福建中醫藥大學附屬康復醫院倫理委員會的批準，所有研究對象已簽署知情同意書。

PSCI入選標準：（1）受試者有神經影像學（CT或MRI）提供的腦血管疾病證據，且CT或MRI提示病變部位在基底節區，無廣泛性病灶；（2）蒙特利爾認知評估量表（montreal cognitive assessment，MoCA）評分<26（對于受過教育不超過12年的人的評分進行1分校正）；（3）所述卒中是患者首次發生并且在本研究前1年內發生；（4）患者生命體征穩定。腦卒中后認知正常（post?stroke cognitive normal，PSCN）組納入標準與PSCI組標準相同，但MoCA評分≥26。AMC組納入標準包括：（1）受試者主訴沒有認知功能障礙。（2）MoCA評分≥26 PSCI組排除標準是：（1）存在其他可引起認知障礙的疾病，如阿爾茨海默病、額顳葉癡呆等腦退行性疾病者；腦腫瘤、腦外傷或腦寄生蟲病及其他原發性認知功能障礙性疾病；（2）醫生或家屬確認患者卒中前長期表現出認知功能障礙或在卒中前使用過與認知功能障礙有關的藥物；（3）影響認知檢查的嚴重言語，視力，聽力障礙或精神障礙的癥狀；（4）貝克抑郁量表（beck depression inventory BDI）得分>13；（5）酒精或藥物濫用；（6）存在以下任何一種情況：心力衰竭，呼吸衰竭或其他器官衰竭；（7）孕婦和哺乳期婦女。PSCN組排除標準與PSCI組相同。AMC組排除標準包括6個條件：（1）阿爾茨海默癥、額顳葉癡呆、腦血管疾病和其他可引起認知障礙的中樞神經系統疾??；（2）另外5個條件與PSCI組的最后5個條件一致。

1.2 血清樣本 在受試者住院后3 d內，在每個受試者的無添加劑的真空血液管中收集血液樣品（5 mL）。將試管垂直保持30 min以形成凝塊，之后在室溫（15～25℃）下以3 000 r/min離心10 min，然后在4℃下以13 000 r/min離心10 min。收集處理后的血清并儲存在-80℃直至進一步分析。

1.3 RNA提取和逆轉錄 使用miRNA純化試劑盒（北京艾德萊公司，RN4601），按照其中的使用說明書來分離提取miRNA。使用NanoDrop2000c分光光度計（德國，Thermo）檢測RNA濃度和純度。RNA濃度范圍為20～102 ng/L。通過測量260～280 nm處的吸光度來檢測RNA純度，其范圍為1.81～2.01。使用miRNAcDNA試劑盒（cwbiotech，CW2141）進行逆轉錄。內參選擇miR?16（序列：TAG CAG CAC GTA AAT ATT GGC GT）。

1.4 實時熒光定量PCR 使用實時熒光定量（qRT?PCR）檢測miRNAs，使用ChamQTM SYBR qPCR Master Mix（MR101?02）（南京諾唯贊生物科技有限公司），把cDNA濃度按照1∶3稀釋。具體操作按照相應的使用說明書。

1.5 統計學方法 使用SPSS 25.0統計軟件包（IBM）進行所有統計分析。計量數據由均值±標準差表示。3組間比較，符合正態分布使用單因素方差分析，不符合正態分布使用Kruskal?Wallis H（K）檢驗。兩組間比較符合正態分布使用兩獨立樣本t檢驗，不符合正態分析使用Mann?WhitneyU檢驗。計數資料由χ2檢驗。通過Spearman進行相關分析以估計miR?191?5p和miR?20a?5p水平分別與MoCA評分之間的相關性，得到相關系數r。一般認為，r>0是正相關，r<0是負相關，r=0是非線性相關（零相關）。如果|r|≥0.7表明兩者高度相關；如果曲線0.7>|r|≥0.4表明兩者中度相關；如果0.4>|r|≥0.2表明兩者低度相關［8］。產生ROC曲線，并分析曲線下面積（area under curve，AUC）以評估miR?191?5p和miR?20a?5p的診斷性能。根據ROC曲線獲得最佳診斷值（Cut?off point），并計算所有4個計數，即真陽性數量（true positive，TP），假陽性數量（false positive，FP），真陰性數量（true negative，TN）和假陰性數量（false negative，FN）。筆者計算靈敏度，特異性如下：靈敏度=TP/（TP+FN）；特異度=TN/（TN+FP）。一般認為，AUC在0.5～1.0的區間內，AUC位于0.5～0.7之間，具有較低的診斷價值；AUC在0.7～0.9之間，具有中等的診斷價值；AUC在0.9～1.0之間，具有較高的診斷價值［8］。

2 結果

2.1 患者特點 顯示了miR?191?5p和miR?20a?5p的人口學信息、生化數據和CT值；患者的一般資料在AMC、PSCN和PSCI之間差異無統計學意義（P>0.05）。以miR?16為內對照，各組間miR?16 Ct值差異無統計學意義（P=0.724，表1、2）。

2.2 血清miRNA相對表達水平 miR?191?5p和miR?20a?5p表達水平在3組中顯著不同（P<0.05）。（1）miR?191?5p在PSCI組表達最高，然后是PSCN組和AMC組，在PSCI和PSCN組（P<0.05）與PSCI和AMC組（P<0.05）之間的成對比較中檢測到PSCI組的miR?191?5p表達差異有統計學意義；與其他兩組相比，PSCI患者血清中miR?191?5p的相對表達顯著上調。（2）miR?20a?5p在PSCI組表達最高，然后是AMC組和PSCN組，在PSCI和PSCN組與PSCI和AMC組之間的成對比較中檢測到PSCI組的miR?20a?5p表達差異有統計學意義（P<0.05）；與其他兩組相比，PSCI患者血清中miR?20a?5p的相對表達顯著上調（表2）。

表1 PSCI、PSCN和AMC組人口學數據的分布Tab.1 Distribution of demographic data in PSCI,PSCN and AMC groups ±s

表1 PSCI、PSCN和AMC組人口學數據的分布Tab.1 Distribution of demographic data in PSCI,PSCN and AMC groups ±s

注：a，計量資料且有一組不符合正態分布，3組間比較采用Kruskal?Wallis H（K）檢驗；b，計量資料且均符合正態分布，方差齊，兩組間采用獨立樣本t檢驗；c，計量資料且有一組不符合正態分布，兩組間采用Mann?Whitney U檢驗；d，計數資料，χ2檢驗

特征年齡（歲）a受教育水平（年）a病程（d）b MOCA評分c性別（例）d男 女腦卒中類型（例）d腦梗死腦出血高血壓病史（例）dd糖尿病史（例）dd高脂血癥史（例）dd心臟疾病史（例）dd吸煙史（例）dd PSCI組（n=36）64.31±1.228 6.67±0.352 50.53±0.762 12.92±0.814 21 15 15 21 22 17 16 9 18 PSCN組（n=36）65.00±1.247 6.56±0.489 50.94±0.656 26.56±0.151 21 15 16 20 23 17 17 9 17 AMC組（n=37）62.27±0.968 6.65±0.345 28.30±0.133 17 20 19 14 19 10 17 P值0.382 0.943 0.560<0.01 0.470 0.812 0.519 0.646 0.838 0.974 0.939

表2 AMC、PSCN和PSCI組兩種血清相對表達量及miR?16Ct值Tab.2 Relative expression and miR-16Ct value of two kinds of serum in AMC,PSCN and PSCI groups ±s

表2 AMC、PSCN和PSCI組兩種血清相對表達量及miR?16Ct值Tab.2 Relative expression and miR-16Ct value of two kinds of serum in AMC,PSCN and PSCI groups ±s

注：對數值進行對數運算log102?ΔCt進而轉變成規范的Ct值，miR?16用作內部參照。a，計量資料且至少有一個不符合正態分布，3組比較用Kruskal?Wallis H（K）檢驗；b，PSCI組和AMC組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；c，PSCI組和PSCN組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；d，AMC組和PSCN組相比，差異無統計學意義（P>0.05）

miR?16Ct值a miR?191?5pa miR?20a?5pa AMC（n=37）29.788±0.470-0.577±0.672 0.331±0.061 PSCN（n=36）29.379±0.454-0.577±0.094 0.166±0.103 PSCI（n=36）29.517±0.390-0.250±0.098bcd 0.743±0.076bcd P值0.724 0.047<0.001

2.3 認知功能與miRNAs水平相關性 筆者分析了MoCA評分與血清miR?191?5p和miR?20a?5p水平之間的相關性。（1）PSCI組和PSCN組中Spearman相關分析結果表明miR?191?5p的相對表達與MoCA評分之間呈中等強度負相關（r=-0.488，P<0.01）；（2）PSCI組和PSCN組中Spearman相關分析結果表明miR?20a?5p的相對表達與MoCA評分之間呈中等強度負相關（r=-0.624，P<0.01）。見表3。

表3 MoCA得分與miRNAs相對表達量間的相關分析Tab.3 Correlation analysis between MoCA score and relative expression of miRNAs

2.4 miRNAs篩選PSCI的診斷性能 通過ROC分析來比較血清miR?191?5p和miR?20a?5p以及兩者聯合對于PSCI的診斷能力。miR?191?5p聯合miR?20a?5p的AUC（95%CI），靈敏度和特異度均明顯高于miR?191?5p或miR?20a?5p單獨的AUC，靈敏度和特異度（P<0.05）。見表4、圖1。

表4 miR?191?5p、miR?20a?5p以及兩者聯合的ROC曲線分析Tab.4 ROC curve analysis of miR?191?5p,miR?20a?5p,and their combination

圖1 ROC曲線Fig.1 ROC curve

3 討論

腦卒中有著極大的危害，我國腦卒中發病率持續上升，平均每年增長8.3%，發病率為403.09/10萬［9］，PSCI的的發病率達到80.97%［10］。PSCI對于患者和家庭造成了極大的困難，因此對于PSCI客觀有效診斷具有極其重要的意義。MoCA是通過循證醫學驗證的的認知障礙篩查，已獲得國際專家的認可［11］，該篩選量表由NASREDDINE等［12］改進和建立。與簡易精神狀態檢查（mini?mental state examination，MMSE）相比，MoCA更加重視執行功能和注意力的評估，并且敏感度更高，因此是一種重要的臨床認知功能工具［12］。然而，MoCA結果受性別，年齡和教育水平的影響，也受到患者主觀因素的影響。目前對于PSCI缺乏比較客觀的診斷指標。因此本課題針對腦卒中患者，探究了聯合血清miR?191?5p和miR?20a?5p水平對PSCI診斷的價值，為臨床實踐提供了客觀有效的參考指標。

有研究［13-14］顯示，miRNA能夠在血循環中穩定存在，且其表達能夠隨著機體病理生理的改變而發生上調或下調。目前研究［14-15］表明miRNA參與調控了腦高級功能（如學習，記憶和情緒等）。而先前的研究也報道了miRNA的表達與神經元突觸可塑性以及認知相關的疾病有關［16-17］，其主要是通過提高基因表達或者減少蛋白的翻譯進而調控神經元突觸的可塑性［18］。LILY等［19］研究發現，miR?191?5p過度表達能夠抑制腦源性神經營養因子（BDNF）的水平，進而抑制突觸可塑性。BEVERIDGE等［20］研究表明miR?20a?5p上調可降低抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤2（BCL 2）等促進神經元分化因子的表達，提示miR?20a?5p是腦發育和神經元分化過程中的關鍵調節因子，對于神經突觸可塑性有著重要作用。miR?191?5p和miR?20a?5p不僅跟神經元細胞突觸可塑性有關，而且與認知學習記憶認知有關。DU等［5］研究顯示，miR?191?5p過度表達會促進細胞死亡，抑制miR?191?5p可以降低中腦動脈閉塞大鼠的梗死面積，并且能夠緩解因缺血缺氧導致的細胞死亡，從而改善認知功能障礙。這與本研究相一致，PSCI患者血清中的miR?191?5p含量明顯高于PSCN患者。miR?191?5p的下調不僅能夠緩解缺血缺氧導致的神經元細胞死亡，而且HU等［6］在研究中發現miR?191?5p的下調與維持小鼠海馬結構重建密切相關，有利于改善記憶和認知障礙。此外，POITZ等［7］實驗表明，miR?20a?5p通過調節缺氧誘導因子1a（hif?1a）的表達，減少卒中后缺氧狀態下神經細胞死亡。綜上所述，miR?20a?5p和miR?191?5p的下調似乎都與緩解缺血缺氧狀態下的神經元細胞死亡相關，從而改善認知障礙。不僅如此，MYRRHE等［21］發現miR?191?5p和miR?20a?5p均與海馬神經元發育和神經元活動變化有關，表明兩者可能參與調控神經元突觸可塑性形成，甚至腦高級活動功能。因此，miR?191?5p和miR?20a?5p可能都與緩解缺血缺氧狀態下神經細胞死亡，促進神經元突觸可塑性形成以及記憶等腦高級活動功能有著密切的聯系，但是目前的研究多集中于基礎實驗，臨床研究較少，而本研究觀察了兩者聯合對于PSCI的診斷價值，其研究是具有一定臨床意義。

本研究結果顯示在PSCI組中，miR?191?5p和miR?20a?5p的表達水平均高于PSCN組和AMC組，進一步通過ROC曲線分析表明miR?191?5p聯合miR?20a?5p對于診斷PSCI的AUC、靈敏度和特異度均高于單一診斷，提示miR?191?5p和miR?20a?5p聯合診斷的可能更具診斷價值，有望成為PSCI早期鑒別診斷的血清生物學標記物。