數(shù)字PCR 技術(shù)的發(fā)展與展望

孫華偉，張敬峰，張小飛＊

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)診斷檢測中心，江蘇 南京 210014）

2019 年10 月24 日-27 日，第22 屆中國北京國際科技產(chǎn)業(yè)博覽會在中國國際展覽中心隆重開幕，并發(fā)布首臺國產(chǎn)全自動一體化數(shù)字PCR 儀，受到國內(nèi)業(yè)界廣泛關(guān)注。數(shù)字PCR 被稱為“第三代”PCR技術(shù)，更擅長對復(fù)雜背景下的標(biāo)本、極微量核酸標(biāo)本進(jìn)行檢測，無疑將更好地解決非洲豬瘟的快速、科學(xué)診斷在養(yǎng)豬臨床中的實(shí)際應(yīng)用。

1 PCR 技術(shù)的發(fā)展歷程

PCR 是模板DNA、引物和dNTP 在DNA 聚合酶作用下發(fā)生酶促聚合反應(yīng)，特異性地合成特定核酸片段并達(dá)到富集的目的，實(shí)現(xiàn)體外擴(kuò)增，得到所需數(shù)目的DNA，然后通過凝膠電泳或熒光定量等方式實(shí)現(xiàn)定性或者定量檢測的方法。使用該方法，即使只有微量的樣本，也能夠通過大量的體外復(fù)制將病原信號加以放大，實(shí)現(xiàn)比較準(zhǔn)確的診斷檢測。PCR 技術(shù)的發(fā)展歷程，見圖1。

2 數(shù)字PCR 比傳統(tǒng)技術(shù)在臨床使用中有何優(yōu)勢？

2.1 數(shù)字PCR 可實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的高度重復(fù)性

圖1 PCR 技術(shù)的發(fā)展歷程

圖2 Q- PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

什么樣的檢測結(jié)果才算是可靠的？這個(gè)問題非常重要，尤其是在非洲豬瘟疫情肆虐的當(dāng)下。任何科學(xué)的檢測，可重復(fù)性都是必須要強(qiáng)調(diào)的，相信不少做過Q-PCR 的實(shí)驗(yàn)室檢測人員碰到過，由于重復(fù)性差而令人崩潰的時(shí)刻。

Q-PCR 被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)室檢測的常規(guī)操作，但由于在Q-PCR 檢測過程中影響擴(kuò)增效率的因素眾多，比如PCR 抑制物、酶等，不能保證其定量分析所依賴的基礎(chǔ)—循環(huán)閾值（CT）的恒定性，使得相同實(shí)驗(yàn)不同次重復(fù)檢測結(jié)果的重現(xiàn)性較差，甚至可能會得到完全相反的結(jié)果，無法滿足越來越嚴(yán)格的定量要求。與Q-PCR 不同的是，數(shù)字PCR 不依賴于CT 值，因此不受擴(kuò)增效率影響，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的高度重復(fù)性。

2.2 可以擺脫對標(biāo)準(zhǔn)品的依賴

在病毒的核酸載量測定方面，Q-PCR 技術(shù)的最大瓶頸在于需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線。因?yàn)槎繒r(shí)需要的標(biāo)準(zhǔn)品既沒有商品化，自己制備起來又很費(fèi)時(shí)費(fèi)力。數(shù)字PCR 基于單分子層面的計(jì)數(shù)可以擺脫對標(biāo)準(zhǔn)品的依賴，從而實(shí)現(xiàn)對病毒核酸的精準(zhǔn)絕對定量。利用數(shù)字PCR 進(jìn)行核酸的病毒載量測定，依賴其高靈敏度的特點(diǎn)，可以用于早期診斷和低拷貝病毒的監(jiān)控，且血液和唾液是數(shù)字PCR 技術(shù)主要應(yīng)用的標(biāo)本類型，見圖2。

3 數(shù)字PCR 在獸醫(yī)檢測推廣中可能會遇到的問題

數(shù)字PCR 實(shí)驗(yàn)室檢測尚無國家或行業(yè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)，數(shù)字PCR的靈敏度較高，因此做好實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制，建立規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的檢測操作流程和結(jié)果評估分析規(guī)程是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的前提。

4 展望

數(shù)字PCR 早已引起生物醫(yī)學(xué)研究者的廣泛關(guān)注，但在獸醫(yī)檢測領(lǐng)域仍處于萌芽階段。數(shù)字PCR 的策略很簡單，就是“分而治之”，這是一個(gè)很好的比喻。DNA 樣品分別在獨(dú)立但相同的分區(qū)中進(jìn)行擴(kuò)增。非洲豬瘟的橫空出世，極大促進(jìn)了Q-PCR 的普及[1]。但通過對江蘇省多家實(shí)驗(yàn)室的臨床調(diào)研發(fā)現(xiàn)Q-PCR在非洲豬瘟病毒的檢測中，重復(fù)性差是一個(gè)反映較為集中的問題。就目前而言，數(shù)字PCR 仍是比較前沿的技術(shù)，但相信在不久的將來，隨著數(shù)字PCR 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的逐漸成熟，數(shù)字PCR 在獸醫(yī)檢測領(lǐng)域扎根發(fā)芽是非常值得期待的，非洲豬瘟的橫空出世將催化這一進(jìn)程。

在非洲豬瘟的防控方面，檢測結(jié)果的準(zhǔn)與不準(zhǔn)是兩個(gè)不同的世界，隔著它們的那層窗戶紙，就是檢測技術(shù)的科學(xué)性。