碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌對替加環素的耐藥機制研究進展

張娣，周志慧

（浙江大學附屬邵逸夫醫院感染科，浙江 杭州）

0 引言

肺炎克雷伯菌是常見的腸桿菌科細菌，據CHINET（中國細菌耐藥性監測網）監測數據，歷年來肺炎克雷伯菌臨床檢出率僅次于大腸埃希菌，位居革蘭氏陰性菌第二名。感染部位可累及呼吸道、泌尿道、腸道、皮膚軟組織等[1]，由于碳青霉烯類抗生素不合理的使用，碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）在全球范圍內不斷增加，已成為最重要的醫院內感染病原體之一[2]，其感染控制難度大，病死率高，迫使我們去尋找新的抗感染方案。替加環素是甘氨酰環素類抗菌藥物，為米諾環素的衍生物，2005 年被美國食品和藥物管理局（FDA）批準使用[3]。它通過可逆結合細菌核糖體30S 亞基，干擾16S rRNA 的A 位點來抑制蛋白質的合成，達到抗菌目的[4]。替加環素對大多數革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和厭氧菌均具有抗菌活性[5,6]，并且是治療CRKP 感染的少數可選擇藥物之一[7]。然而自替加環素上市后，替加環素耐藥的CRKP 菌株（T-CRKP）相繼被報道。因此，為減少細菌耐藥，為臨床診治提供參考，本文就CRKP 對替加環素的耐藥機制以及T-CRKP 感染的治療選擇進行綜述。

1 CRKP 流行現狀

隨著碳青霉烯類藥物大量使用，CRKP 菌株在世界范圍內檢出率逐年增加，美國疾控中心（CDC）報告顯示，2001-2011 年美國耐碳青酶烯類腸桿菌科（CRE）的比例從1.2%增至4.2%，其中CRKP 占CRE 的比例從1.6%增至10.4%[8]。根據CHINET 數據，我國CRKP 菌株檢出率也呈持續上升態勢，肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率從2005 年的3.0%和2.9%分別提高到2018 年的25%和26.3%，耐藥率提高了8 倍以上[9]。產碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制，首例產肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）的肺炎克雷伯菌于1996 年在美國被發現[10]，隨后不同類型的碳青霉烯酶如新德里金屬β-內酰胺酶（NDM）、維羅納整合素編碼的金屬β-內酰胺酶（VIM）、亞胺培南酶金屬β-內酰胺酶（IMP）和苯唑西林酶-48（OXA-48）等也相繼被報道，并在全球范圍內迅速傳播。不同地區碳青霉烯酶的分布也有所不同，我國CRKP 菌株以產KPC 酶為主，產NDM 的肺炎克雷伯菌在美國、加拿大、希臘等歐洲國家較多見，而產OXA-48 型的菌株在土耳其和北非廣泛傳播[11]。近年來，主要流行于國外的碳青霉烯酶類型在國內也開始檢出，如OXA-48 型CRKP 菌株[12]。隨著CRKP 菌株的傳播，其感染率逐年增加，有研究顯示，CRKP 感染是院內死亡的獨立危險因素，死亡率高達40%-50%[13,14]，特別是血流感染（BSI）、入住ICU、實體器官移植（SOT）患者[15,16]。鑒于其高病死率，這迫使我們去尋找有效的抗感染方案。

2 替加環素抗菌機制及應用

替加環素是甘氨酰環素類抗菌藥物，為米諾環素的衍生物，它是在米諾環素四環結構的D 環第9 位碳原子上加入叔-丁基氨基乙酰胺基側鏈。與四環素類作用機制類似，替加環素通過可逆結合核糖體30S 亞基，干擾16S rRNA 的A 位點來抑制細菌蛋白質的合成，達到抗菌目的[4]。由于替加環素存在長側鏈，產生了位阻效應，同時其能與核糖體結合的更緊密，因而能克服細菌對四環素類耐藥的外排泵tet（A-E）和核糖體保護tet（M）機制，對多重耐藥菌有良好的抗菌活性[17]。替加環素不需要根據腎功能情況調整劑量，其療效受患者的年齡、性別或疾病變化等影響較小[6]，在2005 年，已被美國FDA 批準用于治療復雜的腹腔感染，復雜的皮膚軟組織感染以及社區獲得性肺炎（CAP），并建議靜脈用藥首劑100 mg，維持劑量50 mg，q12h，在某些重癥感染情況下，負荷劑量可達200mg，維持劑量100mg，q12h[18]。

3 CRKP 對替加環素耐藥機制研究

自替加環素被批準使用以來，臨床上出現越來越多T-CRKP菌株的報道，我國2018 年CHINET 顯示9225 株CRKP 對替加環素耐藥率達3.6%[9]，較前有增長趨勢，這給臨床的治療帶來了嚴峻挑戰。CRKP 對替加環素的耐藥機制復雜多樣，耐藥結節細胞分裂（RND）型外排泵AcrAB-TolC 過表達是主要耐藥機制，后有研究證實OqxAB、KpgABC 外排泵過表達、tet（A）突變、核糖體蛋白rpsj 基因突變均參與耐藥過程。詳細機制描述如下（圖1）。

3.1 RND 型外排泵

RND 型外排泵過表達介導的替加環素耐藥在革蘭陰性細菌中很普遍，如銅綠假單胞菌中的 MexXY 外排泵、粘質沙雷菌中的SdeXY 外排泵、腸桿菌屬中的AcrAB 和OqxAB 外排泵、大腸埃希菌中的 AcrAB 和AcrEF 外排泵等。在肺炎克雷伯菌中以AcrABTolC 和OqxAB 外排泵為主[19]。

圖1 CRKP 對替加環素耐藥，各調節因子間相互作用

RND 型外排泵中最常見的AcrAB-TolC 外排泵由膜融合蛋白AcrA、膜轉運蛋白AcrB、通道蛋白TolC 三種蛋白組合而成。先前的研究表明AcrAB 蛋白的表達受AraC 家族中的轉錄調節因子調節，分別是RamA、MarA、SoxS 和rarA。它們通過與啟動子相互作用，激活外排泵，賦予替加環素的抗性。而局部抑制因子RamR、MarR、SoxR 分別通過抑制RamA、MarA、SoxS 基因的表達從而抑制外排泵AcrAB 的表達，來發揮負性作用[20-22]，同時抑制因子acrR、Lon 蛋白等這些基因的突變也會導致過度的轉錄激活，引起腸桿菌科中AcrAB 外排泵的上調[21、23、26]。He 等人[23]在三株TCRKP 菌株中發現了ramA 的過表達，進一步的分析證實了這些菌株中存在ramR 突變，用野生型ramR 轉化一個突變體能恢復對替加環素的敏感性，同時抑制ramA 和acrB 的過表達。該研究證實了ramR 突變從而引起ramA 激活AcrAB 外排泵過表達是CRKP 對替加環素耐藥的主要機制。多篇研究報道了RamR 基因最常見的是開放閱讀框內的插入、缺失、點突變等突變類型，而Ye等人[24]發現在2 株TCRKP 菌株中ramR 開放閱讀框ORF 區域無突變，但在其上游核糖體結合區域（RBS）有12 個堿基的缺失，進一步研究發現該缺失不影響ramR 的轉錄，但影響蛋白質合成，間接引起外排泵AcrAB 表達升高，該研究補充了ramR 的突變類型。隨著研究的深入，Rosenblum 等[25]發現部分ramR 基因突變并不影響ramA 的表達水平升高，隨后研究證實ramA 與其周圍基因romA 形成的romA-ramA 基因座受雙啟動子的調控，即兩個ramR結合位點。作者還發現部分菌株無ramR 基因突變，但仍過表達ramA 基因，暗示可能存在次級調控因子控制ramA 表達。Yoo 等人[19]在此基礎上進一步研究，他們獲得的2 株CRKP 菌株均屬于ST147 型，一株對替加環素敏感，另一株耐藥，基因學分析提示耐藥菌株中存在6，096 bp 的片段插入，插入端兩側為TATAT 重復序列，該序列破壞了ramA 上游的romA 基因，導致啟動子替換，從而引起ramA 基因更強的激活。該研究證明ramA 自身的改變，也會引起AcrAB 外排泵上調，從而導致耐藥出現。除了經典的ramA-AcrAB 途徑外，marA、soxS 等均對AcrAB 的過表達起到各自作用，但不占主導地位[23,27]。

在大腸埃希菌中，Lon 蛋白參與marA 的降解，Lon 的缺失或突變會導致marA 濃度升高，從而增加AcrAB 外排泵的表達，引起對替加環素耐藥。Li 等人[26]從替加環素治療CRKP 感染患者的血液中分離出T-CRKP，在替加環素誘導下獲得了6 株替加環素抗性突變體，全基因組測序發現5 株中有Lon 基因突變，包括三種不同類型的點突變，通過構建野生型Lon 質粒，基因敲除回補等試驗證明，Lon 突變體比野生株表現出更高的替加環素的抗性，首次證明Lon 突變參與肺炎克雷伯菌對替加環素耐藥，具體機制需要進一步研究闡明。

同屬RND 家族由質粒編碼的多藥外排泵OqxAB 已被確認介導了腸桿菌科細菌多重耐藥（MDR）。過表達的OqxAB 可降低多種藥物如替加環素、喹諾酮類、呋喃妥因和氯霉素等敏感性[28]。在2012 年，Veleba 等人[29]發現一新型AraC 型轉錄調節因子，命名為rarA，在肺炎克雷伯菌和腸桿菌屬中，染色體編碼的rarA 調節基因位于外排OqxAB 的下游，通過實時定量PCR（RT-PCR）發現rarA 上調的菌株，OqxA 基因的表達也相應升高，同時通過克隆轉化等實驗證實rarA 是OqxAB 外排泵正向調節因子。基因敲除回補實驗發現當敲除acrAB 基因后，即使存在rarA 高表達，該菌株對替加環素的MIC 仍不變，證實了rarA 發揮作用需要功能性AcrAB 外排泵的存在，但獨立于其他AraC 調節基因。后Xue 等[27]發現他們獲得的9 株TCRKP 菌株中，有4 株替加環素MIC 較高（16μg/mL），通過RT-PCR 證實這4 株菌株過表達rarA 及oqxB 基因，另外5 株無過表達，作者認為rarA 以及外排泵OqxAB 在選擇高水平替加環素耐藥菌株中發揮更重要的作用。臺灣一項研究中發現，2 株TCRKP 菌株中無AcrAB 和OqxAB 外排泵的過表達[30]，提示可能還存在其他調節因素參與耐藥過程。

除 了AcrAB-TolC、OqxAB 外 排 泵 外， Nielsen 等 人[31]在2014 年首次發現RND 家族新成員，命名為kpgABC 外排泵。他們分離出的TCRKP 菌株無上述常見的外排泵基因表達量增加或者突變，全基因組測序揭示了在KpgABC 外排泵操縱子上游85 bp存在IS 5 插入序列。既往報道插入序列（IS）可以上調大腸埃希菌中AcrAB 外排泵和鮑曼不動桿菌AdeABC 外排泵的表達，從而引起替加環素非易感性，但在肺炎克雷伯菌中尚未報道。文章通過RT-PCR 發現有IS5 插入序列的菌株存在kpgA 和kpgB 過表達現象，隨后通過對kpgABC 操縱子的克隆轉化實驗進一步證明kpgABC 過表達會導致臨床相關的替加環素耐藥性增加，且不需要功能性AcrAB 外排泵輔助。這一發現補充了我們在CRKP 對替加環素耐藥機制上的認識。

3.2 MFS 型外排泵

Tet（A）蛋白為最常見的主要易化子超家族（MFS）外排泵，主要介導病原體對四環素類抗生素耐藥。既往報道替加環素其能克服細菌對四環素類的抗性機制，而Akiyama T 等人發現沙門菌攜帶的tet（A）基因不僅賦予四環素的抗性，同時也降低了對替加環素的敏感性[32]。隨后有研究證實在大腸埃希菌中Tet 蛋白均可以突變，從而獲得對替加環素的高水平[Tet（A）和Tet（X）]或低水平[Tet（K）和Tet（M）]抗性[33]。2017 年，Sheng[34]等人鑒定出TCRKP 菌株中具有兩個雙移碼突變的tet（A）變體，1 型和2 型，其中2 型是新穎的。用攜帶1 型和2 型tet（A）的質粒轉化的親本菌株分別使替加環素MIC 增加8 倍和4 倍，并通過基因敲除實驗證實在ramR 缺失情況下同時合并tet（A）突變對介導肺炎克雷伯菌替加環素耐藥具有協同作用。Tet（A）突變的報道受到廣泛關注，Du 等人[35]也發現Tet（A）基因中的一個氨基酸取代（S251A）突變是引起替加環素抗性發展的原因，并通過接合實驗證實Tet（A）的可轉移能力。而另有研究觀察到在對替加環素敏感CRKP 菌株中存在與耐藥菌株相同的tet（A）突變體，表明該基因在正常條件下不表達，但在長期使用替加環素處理后可誘導耐藥。此外，tet（A）基因在含有blaKPC-2 基因的接合質粒中被發現[36]，這應引起臨床上高度關注，用替加環素治療該類型CRKP 菌株感染很容易誘導耐藥的進化和傳播。Tet （X）已被證明可以編碼一種依賴于黃素的單加氧酶，這種酶可以修飾替加環素。最近，He 等人[37]報道了動物和人類腸桿菌科和不動桿菌屬中2 種獨特的質粒介導可轉移的替加環素耐藥基因tet（X3）和tet（X4），它們可以使四環素類全部失活包括替加環素以及被FDA 最新批準的eravacycline 和omadacycline。雖然該基因尚未在肺炎克雷伯菌中發現，也未在人類范圍廣泛傳播，但臨床上應警惕腸桿菌科tet（X）變異的發生，這對于評估因tet（X）變異感染而產生高水平替加環素耐藥性的患者的危險因素和臨床結局至關重要。

3.3 核糖體蛋白

替加環素通過與細菌核糖體30S 亞基的結合抑制蛋白質合成來發揮抗性作用。由rpsj 基因編碼的S10 蛋白為30S 核糖體亞基的組成部分，已有報道稱該突變與淋病奈瑟菌中的四環素抗性有關[38]。Villa 等人[22]發現rpsj 基因位于肺炎克雷伯菌基因組的單一拷貝中，并在所有腸桿菌科中都是保守的，該基因突變可能會改變替加環素結合位點附近的核糖體結構或干擾Mg2+的配位，導致替加環素與16S rRNA 的結合較弱，從而引起耐藥。隨后He 等人[39]鑒定出rpsj 基因中的V57L 氨基酸取代突變，與Villa 等人發現相同，通過轉化互補實驗表明rpsJ 突變是替加環素耐藥發生的主要原因，這項研究第一次提供直接的體內證據，證明rpsJ 基因的進化可以導致在替加環素治療CRKP 感染的患者期間產生耐藥。由于該基因位于CRKP 菌株的染色體上，這為臨床上提供警示：在替加環素的選擇性壓力下，可能發生rpsJ 突變，導致耐藥發生，從而使治療失敗。

4 T-CRKP 感染的治療選擇

CRKP 對替加環素耐藥主要為外排泵的過表達所致，多數研究表明用外排泵抑制劑如羰基氫化氯苯腙（CCCP）、苯丙氨酸-精氨酸-β-萘胺（PAβN）、1-（1-萘甲基）哌嗪（NMP）等能不同程度的恢復病原體對替加環素敏感性[23,27,40]，因此目前正在研發的外排泵抑制劑對于T-CRKP 感染患者來說可能是種有效的選擇。多黏菌素能直接結合并中和細菌脂多糖的“脂質A”部分，從而促進細胞裂解發揮抗菌作用[41]，近些年已成為治療CRKP 感染的“最后手段”，然而多黏菌素耐藥的肺炎克雷伯菌相關的報道越來越多，同時基于其腎毒性等不良事件，該藥的選擇受到一定限制。與單一療法相比，抗菌藥物聯合使用能表現良好的優越性。有報道顯示，磷霉素、慶大霉素等較老的抗生素與多黏菌素合用，常能達到較好的療效[42]。

當然，為了應對MDR 微生物的傳播，近年來也開發了一些新型抗生素。頭孢他啶/阿維巴坦是近期被批準使用的三代頭孢與新型β-內酰胺酶抑制劑的組合，已獲許治療腹部感染，尿路感染和醫院獲得性肺炎（HAP），其能夠抑制Ambler A 類，C 類和部分D 類β-內酰胺酶，但對B 類金屬酶無效。因而有研究發現頭孢他啶/阿維巴坦與針對B 類金屬β 內酰胺酶的氨曲南結合，在治療XDR（泛耐藥）肺炎克雷伯菌感染中能發揮良好療效[43]。美羅培南-vaborbactam為碳青霉烯/A 類和C 類β-內酰胺酶抑制劑的組合，2017 年已被FDA 批準用于治療復雜的尿路感染，目前正在進行III 期臨床試驗，評估與哌拉西林/他唑巴坦相比在治療醫院獲得性肺炎（HAP）、呼吸機相關肺炎（VAP）的療效和安全性[44]。Eravacycline是一種新型的全合成四環素，化學結構類似替加環素[45]，對革蘭陽性和陰性耐藥菌均具有廣譜活性，包括表達不同類型的β-內酰胺酶，如產超廣譜β 內酰胺酶（ESBL），KPC 和OXA 的腸桿菌科細菌，顯示出比替加環素更高的抗菌效應[46]，未來可能是治療HAP、VAP 有潛力的抗生素。除了抗生素類，糞便微生物群移植（FMT）近些年來也是研究的熱點，原理就是利用正常微生物菌群取代含有MDR 細菌的功能障礙的微生物菌群[47]，但該理論目前還在實驗階段，其有效性有待進一步商榷。

5 小結與展望

目前，泛耐藥（XDR）肺炎克雷伯菌株的檢出率逐年升高，對全球的公共衛生事業提出新的挑戰。替加環素作為治療CRKP 感染的為數不多的藥物之一，近年來耐藥的報道也呈上升趨勢，其主要機制為RND 型外排泵系統的過表達。近期發現的tet（X）變異體可介導大腸埃希菌對替加環素耐藥，未來可能成為CRKP 對替加環素耐藥的新機制。上述耐藥機制的深入研究，可以為臨床科室防止TCRKP 的爆發流行提供一定參考依據。同時我們強調應合理使用替加環素，延長其使用壽命。針對T-CRKP 感染的治療，當前可用的藥物包括磷霉素、慶大霉素和多黏菌素等舊抗生素以及頭孢他啶/阿維巴坦等新型抗生素。尚未上市的最新型抗生素將來有望成為應對T-CRKP 感染的有效選擇。