飼料中黃曲霉毒素B1和嘔吐毒素生物法降解研究進展

彭 俊，勵 飛，劉 維，聶 勇

（湖南九鼎動物營養研究院有限公司，長沙 410007）

霉菌毒素主要是由真菌產生的具有毒性的次級代謝產物，廣泛存在于糧食、飼用原料、動物飼料中，世界上每年約有25%谷物遭受各種霉菌污染，中國是霉菌毒素的重災區。動物攝入含霉菌毒素食品會引起的急性或慢性毒性，損害機體的肝臟、腎臟、神經組織、造血組織及皮膚組織等。目前，已經發現霉菌毒素300～400種，其中與飼料密切相關的有黃曲霉毒素B1（AFB1）、單端孢霉烯族毒素（T2毒素、嘔吐毒素）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉素（OTA）、煙曲霉素等，影響范圍較廣[1]。如何有效的去除飼料和飼用日糧中的霉菌毒素對動物的健康養殖至關重要。目前常用的去除霉菌毒素主要有微生物法、化學法和物理法，三種常用方法的措施、使用效果和優缺點見附表[2-10]。

附表 霉菌毒素脫毒方法和優缺點比較

由附表可知，目前去除霉菌毒素的物理方法和化學方法都有明顯的弊端，而生物方法降解霉菌毒素具備效率高、安全、環保、成本低等優勢，表現出獨特的優勢和廣闊的研究前景。本文主要介紹飼料及其原料中污染率和污染水平最高的兩種霉菌毒素（AFB1和DON）的特點、危害和致毒機制以及生物脫毒方面的研究進展。

1 黃曲霉毒素B1

1.1 特點和致毒機制

黃曲霉毒素（AFT）是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的次級代謝產物，其主體結構為二呋喃環和香豆素[11-13]。目前經鑒定出的黃曲霉毒素有20多種，主要分為B族、G族和M族等，毒性最強的是AFB1，早在1993年世界衛生組織國際癌癥研究署將AFB1定為一級致癌物[14-15]。AFB1（分子式為C17H12O6，相對分子質量為312.06）分布廣泛、化學性質穩定，也是目前世界公認為天然毒性最強的物質之一，一般的高溫和強酸條件難以將AFB1降解，只有在高溫268～269℃和低pH 1.0～3.0時才有少量降解[16]。但是，AFB1在堿性環境（pH 9.0～10.0）時會迅速被分解，此外AFB1不溶于水，但易溶于乙腈、丙酮、甲醇等[17]。目前，對AFB1的毒性研究主要包括致癌毒性、免疫毒性、生殖毒性和神經毒性等，基本毒性單位是二呋喃環，其氧雜萘鄰酮的結構具有極強的致畸和致癌作用[18]。AFB1經細胞色素氧化酶的作用形成的代謝物AFB1-8,9環氧化合物及之后與DNA、RNA和蛋白質的共價結合是其發揮毒性作用的主要機制[19]。AFB1的主要靶器官是肝臟，動物攝入AFB1后往往會引起發熱、食欲減退、厭食和腹瀉等，發展嚴重會引發急性肝炎、肝細胞壞死、肝充血等癥狀更嚴重會引發肝癌[20]。

1.2 生物吸附法脫除AFB1

采用生物吸附方式脫除AFB1與菌體本身的性質有關，如微生物的細胞壁等。研究發現，真菌類和乳酸菌類對AFB1的吸附效果較好，Bovo等通過噴霧干燥和冷凍干燥處理滅活的鼠李糖乳桿菌，并用兩種干燥后的菌體分別吸附處理AFB1，研究發現噴霧干燥過程中因破壞了細菌細胞壁的結構和功能而完全喪失AFB1的吸附能力，而在冷凍干燥過程中未破壞細胞壁，仍保持吸附AFB1的能力[21]。用于吸附AFB1的細菌中，乳酸菌是被研究最為廣泛的，主要是通過乳酸菌細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺為主要成分的肽聚糖對AFB1進行物理吸附。此外，干酪乳桿菌對用于吸附壁AFB1的吸附率為49.2%，主要是其細胞壁產生胞壁酸的作用效果，開菲爾乳桿菌（Lactobacillus kefiri）同樣對AFB1有很強的吸附能力[22]。目前，研究酵母菌對AFB1的吸附少有報道，禹山林等從16株益生菌中篩選到一株吸附效果最佳的釀酒酵母對AFB1的吸附率是81.16%，試驗表明了其是通過物理方式結合，可通過離心等方式去除，可廣泛應用作飼料添加劑[23]。

1.3 生物降解法脫除AFB1

采用生物降解方式脫除AFB1主要是微生物發酵代謝產物或分泌的酶系破壞毒素的結構，使毒素變為無毒或者低毒產物。孫糧等選出一株對AFB1降解率達到91.8%菌株（將AFB1降解為兩個未知物質P1和P2），經測序定種為地衣芽孢桿菌，并將該菌株的發酵液分為上清液和菌懸液分別用于降解AFB1，結果表明，降解AFB1的活性成分在上清液中，并初步驗證該活性物質是一種胞外酶[24]。王明清等分離到一株蠟樣芽孢桿菌，分析其胞外上清液、菌懸液和胞內液對AFB1的降解率分別是91.7%、11.4%和7.6%，該試驗也表明起作用活性物質主要位于胞外液[25]。Wang等獲得了一種新型嗜熱復合菌系TADC7，由Geobacillus、Clostridium等細菌構成，能在高溫下降解高濃度的AFB1，在120 h內可將0.5 μg·mL-1的AFB1徹底降解，并表示TADC7的上清液起主要解毒作用，這種可徹底降解毒素且耐高溫和高濃度的復合菌系的研究和應用前景廣闊[26]。目前已發現多種細菌和真菌對AFB1有脫除作用，包括枯草芽孢桿菌、惡臭假單胞菌、綠膿桿菌、假蜜環菌、黑曲霉等。研究表明，降解AFB1的活性物質為微生物分泌的蛋白酶系，提取細菌和真菌的發酵粗提液降解AFB1也被廣泛研究。已知的降解AFB1的酶已從不同種類的微生物中被提取純化，并應用于食品和飼料中，包括漆酶、AF氧化酶（AFO）、辣根過氧化物酶、錳過氧化物酶（MnP）、F420H2依賴性還原酶（FDR）等。

2 嘔吐毒素（DON）

2.1 特點和致毒機制

鐮孢霉毒素主要由鐮孢菌、頭孢霉、漆斑菌等產生，其中最重要、數量最多的毒素是單端孢霉烯類毒素（TS），該類毒素包含一百多種化合物，大致分為A類、B類等4個亞類。A類包括T-2毒素、HT-2毒素等，B類包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，又名嘔吐毒素（DON）、雪腐鐮孢菌烯醇（NIV）和鐮孢菌烯酮-X等[27]。嘔吐毒素（分子式為C15H20O6，相對分子質量為296.32）對谷物飼料的污染范圍和對動物的健康危害程度居于單端孢霉烯類毒素之首，易溶于水、乙醇等極性溶劑，和AFB1類似的是：酸性環境、高溫很難破壞其化學結構，而在偏堿性條件下高溫可迅速破壞其化學結構。DON化學式為3a,7a,15-三羥基-12,13-環氧單端孢霉-9稀-8酮，其12,13-環氧環為毒性基團，可與核糖體結合，造成核糖體毒性壓力效應，激活多種蛋白激酶，調節基因表達，抑制蛋白合成并產生細胞毒性，對動物的免疫功能、繁殖功能產生明顯的影響[28-29]。攝入低劑量的DON會導致動物出現厭食、嘔吐、腹瀉、發燒、站立不穩和反應遲鈍等急性中毒癥狀，嚴重時造成骨髓組織的壞死和內臟器官的出血、母畜不孕或流產以及死亡。

2.2 生物吸附法脫除嘔吐毒素

采用生物吸附法脫除DON，也與生物法吸附AFB1類似，主要是真菌類和乳酸菌類對嘔吐毒素的吸附效果較好。Shetty等研究酵母菌和乳酸菌對毒素吸附機制發現主要是這兩類微生物的細胞壁與毒素結合，吸附效果與菌株直接相關[30]。Repecˇkiene˙等研究發現，發酵地霉酵母、美極梅奇酵母、釀酒酵母、馬克思克魯維酵母4種酵母對DON具有良好的吸附效果[31]。Niderkorn等研究29種乳酸菌和丙酸菌對DON的脫除效果，其中有6種有效果，脫除效果與細菌濃度和細菌種類有關，但同樣的細菌濃度，丙酸菌對DON的清除能力低于乳酸菌；活細菌與死細菌對DON的清除能力沒有顯著性差異[32]。Garda-Buffon等研究發現，絲狀真菌米曲霉和米根霉可將DON吸收到菌絲體上，通過深層發酵降解DON，且降解速率在48 h后達到最大[33]。還有研究表明，羅伊乳桿菌的發酵液可抑制鐮刀菌孢子萌發從而減少DON的積累，鼠李屬乳酸菌株和費氏丙酸桿菌株和DON混合可吸附64%～93%的DON[34-35]。

微生物吸收DON的原理主要與葡甘露聚糖在細胞壁上有關，目前從真菌細胞壁提取的葡甘露聚糖的解毒劑已廣泛應用于飼料行業。微生物菌體細胞壁對DON吸附是可逆性的，DON的吸附作用與細菌的種類及濃度有關，因此需要進一步改善吸附劑的質量和穩定性[36-37]。

2.3 生物降解法脫除DON

采用生物降解法脫除DON，主要是通過微生物釋放胞外酶等作用于毒素分子，使其羥化、水解、去環氧化、脫乙酰和糖苷化而分解轉化為低毒化合物[38]。這些微生物主要包含德沃斯氏菌屬、諾卡氏菌屬、動物腸道內的厭氧細菌、芽孢桿菌和真菌等。Shima等從土壤中篩選到一株土壤桿菌屬根瘤菌（Agrobacterium Rhizobium）E3-39，該菌胞外提取液分泌的一種胞外酶，24 h可將培養基中200 μg·mL-1的DON代謝為3-keto-DON[39]。徐劍宏等從土壤和麥穗樣品中分離到一株德沃斯氏菌（Devosia insulae）DDS-1，該菌株對液體培養基中DON降解率＞95%，對小麥飼料中DON降解率達75.47%，研究發現，該菌株可產生一種氧化酶（3-acety-DON，該胞內酶具有較好的溫度和酸堿穩定性），將DON的結構氧化為低毒化合物[40]。Khatibi等比較來自于7種鐮刀菌的3-O-乙酰基轉移酶的特征，篩選出兩種最優3-O-乙酰基轉移酶基因片段FgTRI101和FfTRRI201，并將其克隆到釀酒酵母中成功表達，表達產物可有效降低DON含量[41]。Fuchs等從牛瘤胃中分離到一株厭氧優桿菌屬細菌BBSH797，該菌可將DON代謝成單一產物DOM-1（DOM-1的毒性僅為DON的1/55），已被商業開發為飼料脫毒劑[42-43]。He等使用高濃度DON作為選擇性壓力，從土壤樣品中分離到一株塔賓曲霉NJA-1，NJA-1菌株初酶液體外可轉化94.4%的DON，目前塔賓曲霉NJA-1已申請專利被開發為微生物脫毒制劑[44]。目前不同的微生物發酵的胞內液和胞外液對DON降解研究較廣泛，但其中起作用的具體化合物的基礎研究卻少有報道。

3 總結與展望

目前利用微生物本身或其產生的脫毒酶對AFB1和DON的降解來消除或者降低其危害是目前解決該兩種毒素的有效途徑和研究熱點，主要針對降解AFB1和DON菌株的篩選、鑒定和脫毒條件和方式的優化，但對脫毒物質的分離、純化、降解產物的獲得以及降解產物的相關基因序列和其毒理學研究相對較少。AFB1、DON、ZEN等毒素在飼料及其原料中往往都不是單獨存在，只是不同毒素的含量存在差異，較多學者的研究是以單一毒素降解為目的進行試驗，對同時降解兩種或多種霉菌毒素的研究少有報道。

微生物能降解AFB1和DON，主要是微生物代謝產生的胞內酶和胞外酶起作用，因此今后的研究可更深入研究降解AFB1、DON的胞內酶或胞外酶的分離純化以及獲取關鍵酶的基因序列，應用基因工程方法對基因進行改造，使其關鍵酶活提高。再應用基因工程方可將改造優化后降解AFB1、DON等霉菌毒素的關鍵酶的目的基因轉入其菌體可吸附霉菌毒素的酵母菌或者細菌中，構建雙重高效降解AFB1、DON等霉菌毒素且其菌體可吸附霉菌毒素的工程菌，并應用到飼料及其原料的脫毒產業中。除構建工程菌外，分別篩選高效脫除AFB1和DON的微生物，按照一定比例將兩種及以上微生物組合復配，并優化復配比例，構成復合微生物菌系使其可穩定、高效脫除AFB1、DON等霉菌毒素。研究脫除飼料及其原料中霉菌毒素的工作意義重大，不僅可提高動物飼料安全，而且可減少糧食浪費，對我國動物飼養行業和農業的長足穩定發展影響深遠。