一株具有抑菌活性的凝結芽孢桿菌的篩選、鑒定及其抗逆性研究

韓明渠，李富偉，潘興亮，王玉田，鄭瑞峰

（1.北京科為博生物技術研究院，北京 100086；2.北京市畜牧總站，北京 100101）

對飼用抗生素的限制使用已經(jīng)成為國際社會的共識，“飼料禁抗”是國際畜牧飼料行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。歐盟早在2006年就頒布法令禁止抗生素在飼料中使用，亞洲的日本和韓國也分別在2008年和2011年禁止在飼料中使用抗生素[1]。美國在2017年也開始限制在飼料中使用抗生素[2]。2019年我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194號公告，促生長類藥物飼料添加劑將在2020年全部退出。亟需尋找綠色、安全、高效的抗生素替代品，微生物制劑產(chǎn)品成為國內(nèi)外研究熱點。

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）屬于革蘭氏陽性菌，產(chǎn)芽孢，發(fā)酵后可產(chǎn)生大量的乳酸，屬于腸道乳酸菌，被稱為“有孢子性乳酸菌”[3]。凝結芽孢桿菌具有一般乳酸菌維持動物腸道微生態(tài)平衡、提高動物機體免疫力、提高動物生產(chǎn)性能等作用。同時，由于能產(chǎn)生芽孢，抗逆性強，耐高溫，耐貯存，易于飼料加工，目前中國、美國和歐盟等國家均已將該菌種列入可在畜禽飼料中添加的益生菌[4]。本研究通過MRS培養(yǎng)基平板鈣溶圈法初篩，結合瓊脂擴散牛津杯法進行抑菌性能評估復篩，旨在從雞腸道及內(nèi)容物中篩選具有抑菌作用的凝結芽孢桿菌菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

雞腸道及內(nèi)容物樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

加富MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，葡萄糖5 g，無水氯化鈣0.15 g，氯化鈉2.5 g，硫酸錳0.1 g，L-半胱氨酸0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.2，121℃滅菌30 min。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。

MRS碳酸鈣培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，碳酸鈣6 g，pH 6.0，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌30 min。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g，酵母浸粉0.5 g，NaCl 1.0 g，加蒸餾水至100 mL，pH 7.0，121℃滅菌30 min。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。

人工胃液：取胃蛋白酶1.0 g溶于100 mL無菌水中，用9.5%～10.5%的鹽酸調節(jié)pH到3.0。

人工腸液：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加無菌水500 mL溶解，用0.4%的氫氧化鈉溶液調pH至6.8，加水稀釋至1 000 mL，每100 mL液體中加入1.0 g胰蛋白酶，加入不同量的豬膽鹽，混勻，膽鹽濃度分別為0.1%、0.3%和0.6%。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株篩選

初篩：稱取雞腸道及內(nèi)容物樣品1.0 g，放入裝有玻璃珠的無菌250 mL三角瓶中，加入99 mL無菌水，220 r·min-1振蕩30 min。然后進行10倍梯度稀釋，選取適宜稀釋度涂布在加富MRS培養(yǎng)基固體平板，40℃培養(yǎng)48 h。待菌落長出后，挑取菌落接種到MRS碳酸鈣培養(yǎng)基固體平板上，37℃培養(yǎng)48 h，挑取產(chǎn)生鈣溶圈的菌落，轉接斜面培養(yǎng)基，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

復篩：將從樣品中劃線分離出的菌株，分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r·min-1，培養(yǎng)48 h。以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為病原指示菌，采用瓊脂擴散牛津杯法評估各菌株的抑菌能力，篩選抑菌能力強的菌種。

1.2.2 菌種的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學鑒定

觀察劃線純化后的菌落形態(tài)，并進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2.2 生理生化鑒定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行生理生化實驗[5]。

1.2.2.3 分子生物學鑒定

gyrB基因的PCR擴增與測序：以基因組DNA為模板PCR擴增gyrB基因，擴增引物采用gyrB-F（5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGG NAARTTYGA-3'）和gyrB-R（5'-AGCAGGGTACGGAT GTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'）（生工生物工程股份有限公司合成）[7]。PCR反應體系（20 μL）：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，10 mol·L-1引物1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序為：95℃預變性5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，32個循環(huán)，最后72℃10 min，擴增的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析：擴增產(chǎn)物序列測定由生工生物工程股份有限公司完成。將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST，然后選擇相似性較高的模式菌株序列，利用MEGA 6.0軟件進行多序列同源性比對，用鄰位相連法（NJ法）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1 000次重復的Bootstraps統(tǒng)計學檢驗。

1.2.3 抗逆性研究

菌株人工胃液的耐受性：將菌株CA04121培養(yǎng)物接種于人工胃液中，分別在靜置0、60、120、180 min進行活菌平板計數(shù)。

菌株膽鹽的耐受性：將菌株CA04121培養(yǎng)物接種于不同膽鹽濃度（0、0.1%、0.3%、0.6%）的人工腸液中，分別在靜置6 h后進行活菌平板計數(shù)。

2 結果與分析

2.1 具有抑菌活性凝結芽孢桿菌的篩選

通過加富MRS培養(yǎng)基和MRS碳酸鈣培養(yǎng)基固體平板初篩，抑菌能力評估復篩，得到4株可以產(chǎn)酸并具有抑菌活性的芽孢桿菌菌株，抑菌效果見圖1。其中，菌株CA04121對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較強的抑制作用。

圖1 抑菌效果圖（左圖病原指示菌為金黃色葡萄球菌，右圖病原指示菌為大腸桿菌）

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

在MRS培養(yǎng)基平板表面上，菌落呈圓形，乳白色，不透明，有明顯鈣溶圈；革蘭氏染色呈陽性，細胞呈桿狀，兩端鈍圓，芽孢端生，見圖2。

2.2.2 生理生化特征

接觸酶和V-P測定反應均呈陽性，可在50℃溫度條件下生長，生理生化試驗結果見表1。

2.2.3 gyrB基因序列系統(tǒng)進化分析

菌株CA04121的gyrB基因測序結果在GenBank中進行Blast比對分析，其序列全長為1 184 bp，與芽孢桿菌屬的gyrB基因序列相似性最高。選取Paenibacillus amylolyticus BCRC 14684（EU272024）作為外類群，利用Mega 6.0軟件構建菌株CA04121與芽孢桿菌屬部分模式種gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。菌株CA04121與Bacillus coagulans B10（MH427055）同處一個進化分支，親緣關系最近。

表1 生理生化特征

圖3 gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

通過菌落形態(tài)特征、生理生化特征以及gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結果，將菌株CA04121鑒定為凝結芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），該菌種已保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏編號為CGMCC NO.16244。

2.3 抗逆性能研究

2.3.1 耐酸性能

CA04121菌株在人工胃腸液中的存活率見表2。

表2 CA04121菌株在人工胃腸液中的存活率

由表2可知，在人工胃液中靜置60min，存活率可達90.9%，靜置180 min后存活率仍可達72.7%。該凝結芽孢桿菌菌株具有較強的耐酸能力，能耐受胃酸環(huán)境，為其益生特性的發(fā)揮奠定重要基礎。

2.3.2 耐膽鹽性能

凝結芽孢桿菌膽鹽耐受力見表3。

表3 CA04121菌株在不同濃度膽鹽溶液中的存活率

在膽鹽濃度為0.1%時，菌株存活率達到86.4%，在膽鹽濃度為0.3%時，菌株存活率達到68.2%，而在膽鹽濃度為0.6%時，菌株存活率仍可達到54.5%。因此，該菌株具有良好的耐膽鹽能力。

3 討論與結論

本研究通過MRS培養(yǎng)基平板鈣溶圈法初篩，結合瓊脂擴散牛津杯法進行抑菌性能評估復篩，從雞腸道及內(nèi)容物中得到一株對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較強抑制作用的菌株CA04121。通過形態(tài)特征、生理生化特征以及gyrB基因進化分析結果，鑒定為凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。該菌種具有較好的產(chǎn)酸性能，同時具有較強的抑菌能力。這與嚴濤等從泡菜中分離的凝結芽孢桿菌及趙麗娜從健康仔豬盲腸及糞便中分離的凝結芽孢桿菌[的研究結果基本一致[7-8]。通過抗逆性能研究，該凝結芽孢桿菌菌種在模擬胃液中處理180 min存活率可達到72.7%，在0.6%的膽鹽溶液中處理6 h存活率達到54.5%，結果表明，其可以較好地適應動物腸道環(huán)境。下一步需進行該菌種的工業(yè)化生產(chǎn)及其在動物養(yǎng)殖試驗等方面研究，充分發(fā)揮其在動物養(yǎng)殖過程中調整動物腸道健康、替代抗生素抑制有害菌等方面的應用潛力。