高效液相色譜—串聯質譜法測定雞肉中的氯霉素

徐少華，黃 婷

（深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心廣東省市場監督管理局食用農產品監管重點實驗室，廣東 深圳 518005）

全氯霉素是一種抑制性的廣譜抗生素，可以抑制骨髓細胞中蛋白質的合成，對人類和動物的骨髓細胞和肝細胞具有毒性作用，不僅可引起細胞減少性貧血、血小板減少和再生障礙性貧血，還可導致嚴重的胃腸道反應、二重感染等[1-2]。長期微量攝入氯霉素不僅使沙門氏菌、大腸桿菌等產生耐藥性，還會導致機體正常菌群失調，使人們易患各種疾病。隨著人們生活水平的提高，動物性食品的食用安全越來越受關注。世界上很多國家都對其作出了規定，我國在農業部235號公告中也明確地將氯霉素列為禁用藥物。目前監測氯霉素類藥物殘留的方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、超高效液相色譜-質譜聯用法和酶聯免疫法[3-6]等。現有的氯霉素類藥物檢測方法前處理往往比較復雜，消耗試劑較多，檢測周期長成本高。本研究建立了一種針對雞肉中氯霉素的液相色譜—串聯質譜的檢測方法。本方法減少試劑用量、改善提取液凈化步驟，簡單快捷、靈敏度高，可以檢測市場上雞肉中氯霉素的含量，對質量檢測方法的進步和市民的身體健康有重大意義。

1 材料與方法

1.1 設備與儀器

液相色譜—串聯質譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）（美國Agilent LC 1290/Sciex 5500）；電子天平（感量0.01 g、感量0.000 1 g）（梅特勒電子天平）；高速離心機（美國sigma公司）；固相萃取裝置；超聲波清洗儀；可控溫氮吹濃縮儀；渦旋振蕩器。

1.2 試驗材料

水符合GB/T 6682規定的一級水；標準物質：氯霉素（氯霉素、氯霉素-D5）純度≥99.6%，購自德國DR公司；試劑：甲醇（CH3OH）、乙腈（CH3CN）、甲酸（HCOOH），色譜純：均購自德國默克公司；溶劑：乙腈水溶液：80%乙腈水+0.2%甲酸；甲醇水溶液：10%甲醇水+0.1%甲酸；濾膜：水相，0.22 μm（上海安譜）；PRIME HLB（6 cc 200 mg）固相萃取柱（美國Waters）。

1.3 試劑配制

標準儲備液：每種標準物質均用甲醇配制成1.00 mg·mL-1，在-18℃條件下于棕色瓶中保存，有效期為6個月。

標準中間液（1.00 μg·mL-1）：將標準儲備液用甲醇逐級稀釋成1.00 μg·mL-1標準中間溶液，在-18℃條件下于棕色瓶中保存，有效期為3個月。

內標工作液（100 ng·mL-1）：準確吸取氯霉素-D5內標中間溶液1.0 mL，用甲醇稀釋并定容至10 mL，在4℃條件下于棕色瓶中保存，有效期為3個月。

標準工作液：根據藥物的靈敏度和儀器線性范圍，用乙腈水溶液配成不同濃度的混合標準工作溶液，現配現用。

2 試驗方法

2.1 儀器條件

2.1.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）（美國waters公司）；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：40℃；進樣量：5.0 μL；

流動相及梯度洗脫程序見表1。

表1 氯霉素藥物流動相梯度洗脫

2.1.2 質譜參考條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應離子監測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：-4 500 V。

離子源溫度（TEM）：550℃；氣簾氣CUR：35 psi；碰撞氣壓力CAD：8 psi；噴霧氣GS1：55 psi；輔助加熱氣GS2：55 psi；藥物保留時間、定性定量離子對及去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）見表2。

表2 氯霉素藥物及氯霉素內標的CAS號、保留時間、定性定量離子對及去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）

2.2 前處理

2.2.1 提取

稱取試樣2 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管內，加入100 ng·mL-1的內標工作液（1.3.3）40 μL，加乙腈水溶液（1.2.6）10 mL，震蕩搖勻30 s，超聲波清洗儀超聲5 min，高速離心機6 000 r·min-1離心6 min。

2.2.2 凈化

于上述離心后提取液中移取3.5 mL上清液，直接過6 cc規格PRIME HLB固相萃取柱（6 cc，200 mg），保持速度1 s·滴-1。用玻璃小管收集全部流出液, 準確移出2.5 mL至15 mL帶刻度小管內。流出液在40℃水浴下氮氣吹0.5 mL。殘留液用甲醇水溶液（1.2.7）定容至1.00 mL，過0.22 μm水相濾膜，待上機測定。

2.3 標準工作曲線的制備

精密量取氯霉素藥物的標準溶液適量，用相應的空白樣品基質提取液制備混合標準濃度系列：氯霉素濃度為 0.10、1.00、5.00、20.0、100 μg·L-1，供液相色譜—串聯質譜儀測定，并根據試劑濃度和響應的峰面積制備標準工作曲線。

2.4 試驗靈敏度、回收率和精密度的測試

本試驗以雞肉樣品為基質，添加濃度為0.2 μg·kg-1，按照上述方法進行前處理和測定，平行樣品n=6，根據各樣品檢測值，計算出方法檢出限（MDL），計算公式見式1。

其中k為置信因子取3。本試驗通過陰性樣品加標實驗，根據加標樣品檢測值與加標濃度比值計算實驗回收率。再通過平行加標實驗，計算出試驗的精密度，用于評估實驗誤差和穩定性。

2.5 結果計算

本試驗以內標方法單點校準進行定量測定，計算出試樣中的氯霉素藥物的含量，計算公式見式2。

式中，X-試樣中待測組分殘留量（μg·kg-1）；CS-標準工作溶液濃度（ng·mL-1）；V1-試樣提取體積（mL）；V2-試樣移取體積（mL）；V3-試樣定容體積（mL）；m-樣品稱樣量（g）；A-樣液中待測目標物的峰面積；AS-標準工作溶液的峰面積；Asi-標準工作溶液中內標物的峰面積；Ai-樣液中內標物的峰面積。

注：計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，結果保留3位有效數字。

3 試驗結果

3.1 高效液相條件確定

為尋找分離度好，靈敏度高，峰形尖銳的液相條件，參考相關文獻及檢測標準，選用ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）色譜柱，柱溫為40℃，采用乙腈和水作為流動相，進行梯度洗脫。進樣流速為0.30 ng·mL-1時，氯霉素響應強度1.3×103，背景基線非常低，峰形尖銳，保留時間適中，可有效進行氯霉素藥物的定性定量檢測。

圖1 陰性樣品添加0.1 ng·mL-1氯霉素離子通道色譜圖

3.2 前處理方法的確定

由于雞肉呈現纖維狀，所以需要用本方法先將雞肉做粉碎處理，選用乙腈水溶液作為提取液，超聲離心后可以充分提取氯霉素藥物，其中試劑也起到了稀釋的作用，有利于降低其他成分對于儀器檢測的干擾，并且提高儀器檢測的靈敏度。

3.3 線性范圍和方法檢出限

按照方法條件設置參數，配置一系列不同濃度的標準樣品溶液（0.10、1.00、5.00、20.0、100 μg·L-1），待儀器穩定之后，對系列標準樣品溶液進行測定，繪制其標準曲線，相關系數為r=0.999。

以雞肉樣品為基質，添加濃度為0.2 μg·kg-1，按照上述方法進行前處理和測定，平行樣品n=6，根據各樣品檢測值（0.18、0.20、0.20、0.16、0.20、0.18 μg·kg-1，計算出平均值X（0.187 μg·kg-1）及標準偏差Sb（0.0164），當被分析物的回收率在70%～120%時，可計算方法檢出限為0.05 μg·kg-1。

圖2 陰性樣品添加0.1 ng·mL-1氯霉素-D5離子通道色譜圖

3.4 方法精密度和回收率實驗

以雞肉樣品為基質，進行六組平行加標回收試驗，加標濃度分別為0.2、1.0、2.0 μg·kg-1。將加標樣品和空白樣品按前述方法進行處理，上機測試，加標試驗回收率范圍分別為80%～100%、88%～100%、93～100%。結果見表3。

表3 加標回收試驗精密度和回收率

4討論

本試驗討論建立雞肉中氯霉素藥物高相液相色譜串聯質譜的測定方法。該方法通過乙腈水溶液提取，離心氮吹的處理步驟。最終建立的方法檢出限達到 0.05 μg·kg-1，線性范圍為 0.1～100 μg·L-1，其相關系數r=0.999。雞肉樣品在0.2、1.0、2.0μg·kg-13個水平添加回收實驗條件下，回收率為80%～100%，相對標準偏差RSD為2.67%～8.81%。該方法具有分析過程簡單、穩定性好、定量準確等優點，能滿足雞肉中常見氯霉素藥物快速定性定量檢測的要求。