奧沙利鉑對人舌鱗癌CAL27細胞增殖和凋亡的影響及其機制

張 楚，郝 苗，王會俞，王曉峰，張天夫

(1. 吉林大學中日聯誼醫院口腔科, 吉林 長春 130033;2. 吉林大學中日聯誼醫院科研中心, 吉林 長春 130033)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占口腔癌的90%以上[1-2]，好發于舌部,其次為唇部、頰部和口底部[3-4]。目前臨床上對OSCC的治療主要以手術為主，輔以放化療[5]。但由于口腔獨特的結構特點，術后重建困難，放療和化療藥物均有不良反應，通常導致患者術后生活質量差[6]。因此,尋找和開發能夠有效治療OSCC且不良反應輕的化療藥物并明確其作用機制具有重要意義。鉑類藥物是一種DNA損傷劑，通過形成DNA加合物，誘導腫瘤細胞發生凋亡而發揮細胞毒性，是近幾十年來治療實體腫瘤的重要化療藥物之一。順鉑已成為治療頭頸部腫瘤包括OSCC的一線藥物[7]。奧沙利鉑(Oxaliplatin)是第3代鉑配位復合物，其不良反應輕于順鉑引起腎毒性和卡鉑引起的骨髓抑制[8]。研究表明：Oxaliplatin對多種腫瘤細胞系具有抗腫瘤活性，如結直腸癌[9]、 肝癌[10]和卵巢癌[11]等，是一種理想的化療藥物。然而，目前國際上有關Oxaliplatin對OSCC作用的研究報道較少，且多為從聯合用藥及耐藥性角度探討其抗腫瘤活性，關于Oxaliplatin抑制OSCC細胞增殖的作用及機制尚不明確。因此，本研究通過探討Oxaliplatin對人舌鱗狀細胞癌(簡稱舌鱗癌)CAL27細胞增殖、周期和凋亡的影響，揭示Oxaliplatin的作用機制，從而為臨床應用化療藥物治療舌鱗癌提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人舌鱗癌CAL27細胞株 (美國ATCC細胞庫)，DMEM培養基(美國Corning公司)，青霉素-鏈霉素和胎牛血清(美國Gibco公司)，Oxaliplatin [賽諾菲(杭州)制藥有限公司]，CCK-8檢測試劑盒、TRIzol、結晶紫染液和RIPA細胞裂解液(南京碧云天生物技術有限公司)，細胞凋亡相關檢測試劑盒(天津三箭生物技術有限公司)，PI和RNase(美國Sigma公司)，GAPDH、survivin和Bax抗體(美國CST公司)，逆轉錄試劑盒和SYBR Green[莫納(蘇州)生物技術有限公司]，Western blotting蛋白預染 Marker和GAPDH、周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)以及細胞周期蛋白E (cyclin E)引物(上海生工生物技術有限公司)。實時熒光定量PCR儀(Mastercyclereprealplex 2S，德國Ependoff公司)，流式細胞儀(FC 500MCL，美國Beckman公司)，Odyssey 紅外成像系統(Licor Odyssey ，美國Li-cor公司)。

1.2 細胞培養人舌鱗癌CAL27細胞采用含有10% 胎牛血清及含1% 雙抗的DMEM培養基，置于5% CO2、37℃孵箱中培養，每隔48 h 傳代或更換培養基。

1.3 結晶紫染色觀察細胞形態將CAL27細胞(5×104mL-1)接種于24孔板，過夜培養后，分別用0、40和80 mg·L-1Oxaliplatin處理細胞24 h(對照組、40 mg·L-1Oxaliplatin組和80 mg·L-1Oxaliplatin組)。棄去原有培養基，加入PBS緩沖液漂洗1次，然后每孔緩慢加入500 μL甲醇固定細胞15 min。棄去甲醇并干燥后，每孔加入500 μL結晶紫染液細胞染色10 min。棄去結晶紫染液，PBS緩沖液漂洗3次，待其干燥后，在400×的顯微鏡觀察細胞染色后形態并拍照。

1.4 CCK-8法檢測各組CAL27細胞增殖率將CAL27細胞 (1×104mL-1) 接種于96孔培養板并設置空白組，過夜培養后，采用不同濃度(0、10、20、40和80 mg· L-1) Oxaliplatin處理細胞24 h(對照組和10、20、40及80 mg·L-1Oxaliplatin組)。然后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光，37℃條件下孵育2 h，采用酶標儀檢測細胞在450 nm處的吸光度(A)值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值) ×100%。

1.5 流式細胞術檢測各組CAL27細胞周期按5×105mL-1密度接種CAL27細胞于6孔培養板中，過夜培養至細胞完全貼壁，采用不同濃度(0和80 mg·L-1)Oxaliplatin 處理24 h(對照組和80 mg·L-1Oxaliplatin 組)。預冷PBS緩沖液清洗2次后，加入胰酶(不含EDTA)消化并收集細胞，離心后使用PBS緩沖液清洗1次，加入70%的預冷乙醇冰上固定30 min。PBS緩沖液洗滌2次，每個樣品中加入含20 mg· L-1PI和200 mg·L-1RNase 的染色液，避光孵育 30 min后上機，流式細胞術檢測各組細胞周期分布情況。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測CAL27細胞中CDK2和cyclin E mRNA表達水平采用上述方法處理并收集細胞，應用TRIzol法提取出細胞的總RNA，使用逆轉錄試劑盒將部分總RNA逆轉錄至cDNA，逆轉錄條件：37℃、2 min，55℃、 15 min，85℃、10 s。PCR引物序列設計如下：GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′; CDK2 上游引物5′-GCTAGCAGACTTTGGACTAGCCAG-3′，下游引物5′-AGCTCGGTACCACAGGGTCA-3′; cyclin E上游引物5′-TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAG-CC-3′，下游引物5′-TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC-3′。使用實時熒光定量PCR儀進行擴增，擴增條件： 95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，循環40次。采用2-ΔΔCt法計算mRNA表達水平。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率采用上述方法處理并收集細胞，根據Annexin Ⅴ- FITC/PI雙染色凋亡檢測試劑盒說明測定細胞凋亡情況，每個樣品加入5 μL Annexin Ⅴ溶液避光孵育15 min，再加入5 μL PI溶液避光孵育5 min，最后各加入400 μL PBS緩沖液，流式細胞術檢測細胞凋亡率。細胞總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.8 Western blotting法檢測CAL27細胞中Bax和survivin蛋白表達水平采用0、40和80 mg·L-1Oxaliplatin處理并收集細胞，冰上RIPA處理后超聲15 s，離心收集蛋白，蛋白質定量后在樣品中加入加樣緩沖液，金屬浴煮沸10 min。采用 15% SDS-PAGE凝膠在80～120 V的電壓條件下電泳分離蛋白條帶，然后在100 V恒壓下將蛋白轉移至PVDF膜上。室溫條件下使用含有 5%脫脂牛奶的 TBST 溶液封閉 PVDF膜1 h，然后分別放入1∶1 000 濃度稀釋后的GAPDH、Bax和survivin抗體，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，室溫條件下，在1∶30 000稀釋的二抗中避光孵育1 h，TBST洗滌3次，采用Odyssey 紅外成像系統掃描結果。使用Image J軟件進行灰度分析，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表達目的蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組CAL27細胞形態表現隨著藥物作用濃度的升高，CAL27細胞形態發生明顯的變化。對照組細胞形態與ATCC細胞庫中的數據相似，細胞呈多邊形，貼壁良好，胞間連接緊密，細胞核深染；40 mg·L-1Oxaliplatin組細胞出現一定程度的皺縮，細胞間連接不緊密；80 mg·L-1Oxaliplatin組細胞明顯皺縮，部分胞膜溶解破裂，失去原有形態，細胞間連接喪失，平均染色強度低。見圖1(插頁二)。

2.2 各組CAL27細胞增殖率與對照組比較，不同濃度Oxaliplatin組CAL27細胞增殖率明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且呈濃度依賴性。見圖2。

2.3 各組CAL27細胞周期分布情況與對照組比較，40 mg·L-1Oxaliplatin組G0/G1期和G2/M期CAL27細胞百分比明顯升高(P<0.01)，S期CAL27細胞百分比明顯降低(P<0.05)，表明CAL27細胞出現了G0/G1期阻滯。見表1和圖3。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group(0 mg·L-1Oxaliplatin group).

圖2 CCK-8法檢測各組CAL27細胞增殖率

Fig.2 Proliferation rates of CAL27 cells in various groups detected by CCK-8 assay

2.4 各組CAL27細胞中CDK2和cyclin E mRNA表達水平與對照組比較，40 mg·L-1Oxaliplatin組CAL27細胞中CDK2和cyclin E mRNA表達水平明顯降低 (P<0.05)。見圖4。

2.5 各組CAL27細胞凋亡率與對照組比較，40和80 mg·L-1Oxaliplatin組均發生細胞凋亡。40 mg·L-1Oxaliplatin組主要呈現為早期凋亡，與對照組比較，總凋亡率 (16.10 %±0.42%)明顯降低(P<0.01)。80 mg·L-1Oxaliplatin組8.1% 的細胞呈現早期凋亡，12.0%的細胞呈現晚期凋亡；與對照組比較，總凋亡率 (20.70%±0.84%) 明顯降低(P<0.01)。見圖5。

表1 2組不同細胞周期CAL27細胞百分比

GroupPercentage of CAL27 cellsG0/G1SG2/MControl23.99±0.5245.61±0.7430.40±0.2340 mg·L-1 Oxaliplatin28.49±0.39??38.97±0.87?32.45±0.48?

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group.

A:Control group;B:40 mg·L-1 Oxaliplatin group.

Fig.3 Cell cycle distribution of CAL27 cells in two groups detected by flow cytometry

2.6 各組CAL27細胞中Bax和survivin蛋白表達水平與對照組比較，40和80 mg·L-1Oxaliplatin組CAL細胞中Bax蛋白表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，survivin蛋白表達水平則明顯降低(P<0.01)。見圖6。

*P<0.05 compared with control group.

圖4 實時熒光定量qPCR法檢測各組CAL27細胞中CDK2和cyclin E mRNA表達水平

Fig.4 Expression levels of CDK2 and cyclin E mRNA in CAL27 cells in various groups detected by Real-time fluoresence quantitative PCR

A: Control group; B: 40 mg·L-1Oxaliplatin group; C: 80 mg·L-1Oxaliplatin group.

圖5 流式細胞術檢測各組CAL27細胞凋亡率

Fig.5 Apoptotic rates of CAL27 cells in various groups detected by flow cytometry

Lane 1: Control group; Lane 2: 40 mg·L-1Oxaliplatin group; Lane 3: 80 mg·L-1Oxaliplatin group;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

圖6 各組CAL27細胞中Bax和survivin蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B)

Fig.6 Electrophoregram (A) and histogram (B) of Bax and survivin protein expressions in CAL27 cells in various groups

3 討 論

OSCC是頭頸部常見惡性腫瘤類型之一，惡性程度高，死亡率高，患者生存質量較差[12-13]。鉑類藥物是當前臨床治療頭頸部腫瘤包括OSCC的主要化療藥物之一[8]，Oxaliplatin是第3代鉑類藥物[9]，目前臨床廣泛應用于治療消化道腫瘤[14]。但Oxaliplatin對OSCC的作用效果和作用機制還不夠明確。因此，本文作者通過研究不同濃度Oxaliplatin作用于OSCC CAL27細胞，觀察其對細胞形態、增殖、周期和凋亡等的影響，探討Oxaliplatin體外對CAL27細胞的潛在作用機制。

本研究結果顯示：Oxaliplatin能明顯改變細胞形態，使細胞失去緊密連接；同時，Oxaliplatin能明顯抑制CAL27細胞增殖；通過調節CDK2和cyclin E的表達水平，誘導G0/G1期阻滯；通過下調survivin的表達及上調Bax的表達，最終誘導CAL27細胞發生凋亡。

腫瘤發生是一種細胞周期調控異常所導致的細胞增殖失控的現象，因此阻滯細胞周期通常是腫瘤治療的重要手段之一[15]。已有研究[16]表明：Oxaliplatin在體內活化后，形成鉑化的 DNA 化合物,從而造成DNA損傷并抑制DNA的修復及合成，誘導細胞發生凋亡。許多化療藥物也是通過引起DNA損傷的方式，誘導細胞發生周期阻滯或凋亡，進而發揮抗腫瘤作用，如順鉑[17]、博萊霉素[18]和環磷酰胺[19]等。

本研究采用的Oxaliplatin是一種細胞周期非特異性化療藥，具有細胞種屬特異性。ATALLAH 等[20]研究發現：15 mg·L-1Oxaliplatin聯合熱療可誘導人卵巢癌IGROV-1細胞出現短暫的G2/M阻滯；而對于Caco-2和HT-29 2種結腸癌細胞，則出現G0/G1期細胞減少，G1/S阻滯。本研究結果顯示：Oxaliplatin可誘導CAL27細胞發生G0/G1期阻滯，表明Oxaliplatin在不同細胞中所發揮的周期阻滯調控作用有所差異。在維持正常細胞周期調控中，細胞周期蛋白(cyclins)和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKS)間的相互作用起著重要的作用[21]。哺乳動物細胞由G1期轉化到S期的調控主要包括cyclin E/CDK2以及cyclin D/CDK4的激活[22]。本研究結果顯示：Oxaliplatin能下調CDK2與cyclin E的表達，該結果與G0/G1期細胞百分比增多而S期細胞百分比減少結果一致，表明在CAL27細胞中，Oxaliplatin能通過下調cyclin E及CDK2的表達調控細胞周期，抑制細胞增殖。

細胞凋亡是抗癌藥物抑制癌細胞生長增殖的重要機制,線粒體通路則是誘導凋亡發生的主要信號通路之一。Bcl-2家族蛋白通常是線粒體凋亡通路上的重要相關因子，抗凋亡蛋白及促凋亡蛋白通過調節線粒體膜的通透性來控制細胞的凋亡[23]。Bax是存在于線粒體外膜的一種促凋亡蛋白，Bax能有效促進細胞色素C的釋放，刺激Caspase-9蛋白的水解，從而激活凋亡關鍵蛋白Caspase-3[24]。SHEN等[25]研究發現：細梗香草皂苷C(capilliposide C，CPS-C)能明顯增強Oxaliplatin對人食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)細胞的敏感性，誘導細胞凋亡，Oxaliplatin聯合CPS-C可明顯提高Bax蛋白的表達。本研究結果顯示：Oxaliplatin能上調Bax蛋白的表達，表明Oxaliplatin可能是通過激活線粒體通路誘導CAL27細胞凋亡。

此外，survivin是一種新型的抗凋亡蛋白，是重要的腫瘤相關抗原。已有研究[26]顯示：在口腔相關癌前病變及OSCC中均發現高表達的survivin。因此，下調survivin能夠增強腫瘤細胞對凋亡的敏感性。研究[27]顯示：Oxaliplatin對survivin的抑制作用能夠提高頭頸部鱗癌對紫杉醇化療的敏感性。KHAN等[28]發現高表達的survivin能抑制部分頭頸部鱗癌細胞的凋亡，促進細胞對放療產生抗性，而Oxaliplatin則能夠通過下調survivin的表達，增敏放療誘導的細胞毒性。本研究結果顯示：隨著Oxaliplatin濃度增加，survivin表達明顯降低，且細胞凋亡率升高。

綜上所述，Oxaliplatin能夠引起人OSCC CAL27細胞形態的改變，抑制細胞增殖，通過下調CDK2與cyclin E的表達水平誘導細胞發生G0/G1期阻滯，并在一定程度上通過對 Bax和survivin的調節誘導細胞凋亡，本研究結果將為臨床應用Oxaliplatin治療OSCC提供可行性和有效性依據。