七氟醚對HT22小鼠海馬神經元細胞DNA的損傷及其機制

王雪冬，王迎迎，劉索寧，王 靖，劉昊鵬，劉 楠，裴愛月，秦 晶，馮春生，樸美花

(1.吉林大學第一醫院麻醉科，吉林 長春 130021；2.吉林大學第一醫院胃結直腸外科，吉林 長春 130021；3.吉林大學第一醫院內鏡中心，吉林 長春 130021)

吸入麻醉藥七氟醚具有血氣分配系數低、血流動力學穩定和蘇醒快等優點，被廣泛應用于外科手術麻醉。但近年來研究[1]發現：發育中大腦暴露于七氟醚中會導致廣泛的神經元凋亡和神經退行性改變，進而導致遠期的學習記憶、認知障礙和行為異常。已有研究[2-4]顯示：七氟醚能夠對未成熟腦產生神經毒性作用，進而誘發長期的腦功能發育障礙，但其機制尚不完全清楚。有研究[5]表明七氟醚通過影響新生大鼠大腦中的代謝途徑，從而產生腦神經毒性作用。也有研究[6]表明氧化酶抑制劑可減少七氟醚導致的新生鼠長期記憶功能損害。DNA是生物的主要遺傳物質，其完整性的維系對生命個體生存和維持物種穩定起至關重要的作用。研究[7]顯示：DNA損傷修復基因的敲除能夠導致小鼠胚胎神經發育異常和神經元細胞死亡，進而誘發長期腦功能障礙。研究[8]證實吸入麻醉藥異氟醚能夠通過誘導DNA損傷引起老年小鼠腦神經損傷及加重神經退行性改變。但七氟醚的神經毒性作用是否與DNA損傷有關尚無明確報道。因此，本研究以HT22小鼠海馬神經元細胞為研究對象，觀察七氟醚對海馬神經元細胞DNA損傷的影響，闡明其誘導腦神經毒性作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器HT22小鼠海馬神經元細胞購于上海生物科技有限公司。DMEM高糖培養液、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、多聚賴氨酸、0.25%胰蛋白酶和磷酸緩沖液(PBS)均購于美國Gibco公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)和抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)購自美國Sigma公司，乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒和DCFH-DA活性氧檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，七氟醚購于艾伯維醫藥貿易(上海)有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購于美國Pierce公司，小鼠抗Histone蛋白購于美國Proteintech公司，小鼠抗毛細血管擴張性共濟失調突變蛋白(ATM)、磷酸化ATM(p-ATM)和抗γ-H2AX抗體購于美國Abcam公司，8-OHdG抗體購于美國Abbiotec公司。細胞培養箱(美國Billups-Rothenberg公司)，熒光光譜儀(美國PerkinElmer公司)， IX71 倒置熒光相差顯微鏡(日本Olympus公司)，Model550型全自動酶標儀 (美國Bio-Rad公司)。

1.2 細胞培養HT22小鼠海馬神經元細胞培養在DMEM培養液(含10%熱滅活胎牛血清、1%谷氨酰胺、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)中，于37℃、95%O2和5%CO2的飽和濕度培養箱中培養，每3 d換液1次，待單層細胞達70%～80%融合后，采用0.25%胰酶消化后傳代培養。

1.3 細胞分組和藥物處理取對數生長期HT22小鼠海馬神經元細胞種植于96孔培養板中，細胞密度為每孔5×103個，每組6孔。HT22細胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養液中，在37℃、5%CO2條件下培養24 h后，棄去原培養液，加入含10%胎牛血清培養液2 h，將細胞隨機分為空白對照組、2%七氟醚組(2%Sevo 6 h組、2%Sevo 12 h組和2%Sevo 24 h組)、4%七氟醚組(4%Sevo 6 h組、4%Sevo 12 h組和4%Sevo 24 h組)和8%七氟醚組(8%Sevo 6 h組、8%Sevo 12 h組和8%Sevo 24 h組)。采用MTT法和LDH法分別檢測各組HT22小鼠海馬神經元細胞存活率和死亡率。根據實驗結果將細胞再次分為生理鹽水組、生理鹽水+4%Sevo 12 h組、生理鹽水+8%Sevo 12 h組、NAC組、NAC+4%Sevo 12 h組和NAC+8%Sevo 12 h組，根據分組分別給予生理鹽水或5 mmol·L-1NAC預處理1 h后，予以4%或8%濃度的七氟醚處理12 h。

1.4 MTT法檢測細胞存活率將各組HT22小鼠海馬神經元細胞進行相應的實驗處理后接種于96孔培養板中，進行相應藥物處理一定時間(6、12和24 h)后，每孔加入20 μL MTT溶液，37℃孵育4 h后吸棄孔內上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，采用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度(A)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.5 LDH法檢測細胞死亡率將各組HT22小鼠海馬神經元細胞進行相應的實驗處理后接種于96孔培養板中，進行相應藥物處理一定時間(6、12和24 h)后，每孔加入20 μL LDH釋放液，37℃避光孵育1 h后吸棄孔內上清液，離心5 min，取各自上清液120 μL轉移至新的96孔培養板，加入LDH反應液60 μL，于25℃避光振蕩30 min，采用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔A值，計算細胞死亡率。細胞死亡率=(實驗組A值-對照組A值)/(空白對照組A值-對照組A值)×100%。

1.6 單細胞凝膠電泳(彗星實驗)檢測細胞DNA雙鏈損傷程度參照BROZOVIC等[9]的實驗方法，將第2次分組的HT22小鼠海馬神經元細胞給予生理鹽水或5 mmol·L-1NAC預處理1 h后，予以4%和8%七氟醚處理12 h，制備細胞懸液，用PBS緩沖液調整細胞密度為每毫升1×104～1×105個，采用低熔點瓊脂糖溶解制片后經裂解、電泳、閱片，觀察DNA遷移長度，以DNA遷移長度表示DNA雙鏈損傷程度。

1.7 Western blotting法檢測各組細胞中DNA損傷相關蛋白表達量向各組HT22海馬神經元細胞中加入PBS緩沖液，進行3次離心后取上清，提取細胞總蛋白。采取BCA試劑盒進行蛋白定量。取各組蛋白質20～40 μg，經10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離后，電轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入1∶500比例稀釋的小鼠抗Histone、抗8-OHdG、抗ATM、抗p-ATM和抗γ-H2AX抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根抗過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h后洗膜，將PVDF膜用發光試劑ECL顯色后成像。采用Image J凝膠圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值，每個樣本重復3次。

1.8 DCFH-DA染色法分析細胞中活性氧(ROS)水平將生理鹽水組、生理鹽水+4%Sevo 12 h組、生理鹽水+8%Sevo 12 h組、NAC組、NAC+4%Sevo 12 h組和NAC+8%Sevo 12 h組HT22小鼠海馬神經元細胞接種于96孔培養板中，給予生理鹽水或NAC預處理1 h后，予以4%和8%七氟醚處理12 h，應用 DCFH-DA染色，在激發波長502 nm、發射波長530 nm附近，使用熒光顯微鏡分析細胞中ROS熒光強度，以熒光強度表示ROS水平。

2 結 果

2.1 各組HT22小鼠海馬神經元細胞存活率與空白對照組比較，2%Sevo 6 h組、2%Sevo 12 h組和2%Sevo 24 h組細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)；在同一濃度(4%Sevo組和8%Sevo組)時，七氟醚呈時間依賴性地抑制HT22小鼠海馬神經元細胞存活(P<0.05)；與空白對照組比較，在同一時間點，4%和8%Sevo組HT22小鼠海馬神經元細胞存活率明顯降低(P<0.01)，且存活率隨七氟醚濃度增加而降低(P<0.05)。經NAC預處理后給予七氟醚，NAC+4%Sevo 12 h組和NAC+8%Sevo 12 h組細胞存活率分別為(91.3±2.1)%和(90.4±1.9)%，明顯高于生理鹽水+4%Sevo 12 h組(86.3%±1.7%)(P<0.01)和生理鹽水+8%Sevo 12 h組(81.4%±2.2%)(P<0.01)。見圖1和圖2。

*P<0.01 compared with blank control group(0% sevoflurane group)；△P<0.05 compared with 4%Sevo group;#P<0.05 compared with 6 h;○P<0.05 compared with 12 h..

圖1 MTT法檢測各組HT22小鼠海馬神經元細胞存活率

Fig.1 Survival rates of HT22 mouse hippocampal neuronal cells of HT22 mice in various groups detected by MTT method

2.2 各組HT22小鼠海馬神經元細胞死亡率與空白對照組比較，2%Sevo 6 h組、2%Sevo 12 h組和2%Sevo 24 h組細胞死亡率差異無統計學意義(P>0.05)；在同一濃度(4%Sevo組和8%Sevo組)時，七氟醚呈時間依賴性地促進HT22小鼠海馬神經元細胞死亡(P<0.05)；與空白對照組比較，在同一時間點4%和8%Sevo組HT22小鼠海馬神經元細胞死亡率明顯升高(P<0.01)，且死亡率隨著七氟醚濃度增加而升高(P<0.05)。與生理鹽水+4%Sevo 12 h組比較，NAC+4%Sevo 12 h組HT22小鼠海馬神經元細胞死亡率明顯降低(P<0.01)。與生理鹽水+8%Sevo 12 h組比較，NAC+8%Sevo 12 h組HT22小鼠海馬神經元細胞死亡率明顯降低(P<0.01)。見圖3和圖4。

圖2 MTT法檢測NAC預處理后各組HT22小鼠海馬神經元細胞存活率

Fig.2 Survival rates of HT22 mouse hippocampal neuronal cells in various groups after NAC pretreatment detected by MTT method

*P<0.01 compared with blank control group(0% sevoflurane group)；△P<0.05 compared with 4% Sevo group;#P<0.05 compared with 6 h;○P<0.05 compared with 12 h.

圖3 LDH法檢測各組HT22小鼠海馬神經元細胞死亡率

Fig.3 Mortalities of HT22 mouse hippocampal neuronal cells in various groups detected by LDH assay

2.3 各組HT22小鼠海馬神經元細胞DNA雙鏈損傷情況與生理鹽水組比較，生理鹽水+4%Sevo 12 h組和生理鹽水+8%Sevo 12 h組HT22小鼠海馬神經元細胞DNA遷移長度明顯增加，說明DNA雙鏈損傷增多。與生理鹽水+4%Sevo 12 h組比較，生理鹽水+8%Sevo 12 h組DNA雙鏈遷移長度增加。與生理鹽水+4%Sevo 12 h組和生理鹽水+8%Sevo 12 h組比較，NAC+4%Sevo 12 h組和NAC+8%Sevo 12 h組DNA雙鏈遷移長度明顯減少，說明DNA損傷明顯減少。見圖5(插頁二)。

圖4 LDH法檢測NAC預處理后各組HT22小鼠海馬神經元細胞死亡率

Fig.4 Mortalities of HT22 mouse hippocampal neuronal cells in various groups after NAC pretreament detected by LDH assay

2.4 各組HT22小鼠海馬神經元細胞中DNA損傷相關蛋白8-OHdG、ATM、p-ATM和γ-H2AX蛋白表達量與空白對照組比較，2%Sevo 12 h組HT22小鼠海馬神經元細胞中8-OHdG、ATM、p-ATM和γ-H2AX蛋白表達量無明顯變化；與空白對照組和2%Sevo 12 h組比較，4%Sevo 12 h組和8%Sevo 12 h組HT22小鼠海馬神經元細胞中8-OHdG、ATM、p-ATM和γ-H2AX蛋白表達量明顯增加。與生理鹽水+4%Sevo 12 h組和生理鹽水+8%Sevo 12組比較，NAC+4%Sevo 12 h組和NAC+8%Sevo 12 h組，HT22小鼠海馬神經元細胞中8-OHdG、ATM、p-ATM和γ-H2AX表達量均降低。見圖6和圖7。

2.5 各組HT22小鼠海馬神經元細胞中ROS水平與生理鹽水組比較，生理鹽水+4%Sevo 12組和生理鹽水8%Sevo 12 h組可觀察到HT22小鼠海馬神經元細胞內有更明亮的綠色熒光，說明細胞內ROS積聚增多。與生理鹽水+4%Sevo 12組和生理鹽水+8%Sevo 12 h組比較，NAC+4%Sevo 12 h組和NAC+8%Sevo 12 h組HT22小鼠海馬神經元細胞內綠色熒光明顯減少，ROS水平明顯降低(P<0.01)。見圖8(插頁二)和圖9。

Lane 1:Blank control group;Lane 2:2% Sevo 12 h group;Lane 3:4% Sevo 12 h group;Lane 4:8% Sevo 12 h group.

圖6 Western blotting法檢測各組HT22小鼠海馬神經元細胞中8-OHdG、ATM、p-ATM和γ-H2AX蛋白表達電泳圖

Fig.6 Electrophoregram of expressions of 8-OHdG，ATM，p-ATM and γ-H2AX proteins in HT22 mouse hippocampal neuronal cells in various groups detected by Western blotting method

Lane 1:Normal saline group;Lane 2:NAC group;Lane 3:Normal saline+4%Sevo 12 h grouop;Lane 4:NAC+4%Sevo 12 h group;Lane 5:Normal saline+8%Sevo 12 h group;Lane 6:NAC+8%Sevo 12 h group.

圖7 Western blotting法檢測NAC預處理后各組HT22小鼠海馬神經元細胞中8-OHdG、ATM、p-ATM和γ-H2AX蛋白表達電泳圖

Fig.7 Electrophoregram of expressions of 8-OHdG，ATM，p-ATM and γ-H2AX proteins in HT22 mouse hippocampal neuronal cells in various groups after NAC pretreatment detected by Western blotting method

3 討 論

HT22小鼠海馬神經元細胞是體外研究神經毒性的良好模型，廣泛應用于腦神經性疾病研究中。臨床上嬰幼兒七氟醚最低肺泡有效濃度(MAC)值約為2.5%，這是本實驗選擇七氟醚用藥濃度的依據。有研究[3-4, 10-12]顯示：吸入麻醉藥七氟醚能夠引起不同種屬的嬰幼個體未成熟大腦產生廣泛的神經毒性作用，導致神經元死亡。研究[13]表明：七氟醚能夠抑制小鼠胚胎干細胞增殖分化，對胎兒發育產生毒性作用。本研究結果顯示:臨床相關濃度的七氟醚具有神經細胞毒性作用，能夠時間和劑量依賴性地誘導HT22海馬神經元細胞死亡、抑制細胞存活。本研究結果與上述觀點相一致。

圖9 各組HT22小鼠海馬神經元細胞中ROS水平

Fig.9 ROS levels in HT22 mouse hippocampal neuronal cells in various groups

在生命進程中，DNA不斷受到體內外多種有害因素刺激，如紫外線、毒性化學物質和細胞代謝過程中產生的氧自由基等，進而導致DNA損傷。DNA損傷可以表現多種類型，如DNA單鏈斷裂、DNA雙鏈斷裂和DNA鏈交聯等，這些受損DNA擾亂細胞穩態平衡，引起基因突變，導致細胞畸變、老化和死亡等。研究[14]表明：DNA損傷與多種神經系統疾病的發生相關，在這些神經系統疾病中存在DNA損傷及異常的DNA修復，最終導致神經元正常功能的缺失以及神經細胞死亡。單細胞凝膠電泳是檢測細胞DNA雙鏈損傷斷裂的敏感方法。本研究檢測了七氟醚對HT22小鼠海馬神經元細胞DNA雙鏈損傷的影響，結果發現：七氟醚能夠誘導HT22小鼠海馬神經元細胞DNA雙鏈損傷，并與七氟醚的濃度呈正相關關系。為了進一步驗證七氟醚對DNA損傷的影響，本研究檢測了DNA損傷相關蛋白8-OHdG、ATM、p-ATM和γ-H2AX的表達。ATM是直接感受DNA雙鏈斷裂損傷并起始諸多DNA損傷信號反應通路的感受器，Ser1981的ATM磷酸化產生p-ATM，ATM磷酸化激活組蛋白H2AX產生磷酸化的γ-H2AX，進而啟動DNA損傷修復過程。8-OHdG是活性氧自由基攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產生的一種氧化性加和產物，其與DNA氧化損傷相關。本研究結果顯示：與空白對照組比較，2%Sevo組HT22小鼠海馬神經元細胞中DNA損傷相關蛋白8-OHdG、ATM、p-ATM和γ-H2AX表達量未發生明顯改變。與空白對照組和2%Sevo組比較，4%Sevo組和8%Sevo組HT22小鼠海馬神經元細胞中DNA損傷相關蛋白8-OHdG、ATM、p-ATM和γ-H2AX表達量明顯增多，且與七氟醚的濃度有關聯。NI等[8]研究證實吸入麻醉藥異氟醚誘導老年小鼠大腦神經細胞死亡與DNA損傷密切相關。研究[15]發現：七氟醚和異氟醚暴露均能夠造成青年志愿者外周血淋巴細胞中DNA損傷與斷裂。

引起細胞內DNA損傷的原因大致可以分為環境因素、DNA自發性損傷以及細胞內產生過多的ROS等，其中細胞內的ROS增多是最引人關注的DNA損傷因素。ROS是細胞正常代謝過程中產生的副產物，生理情況下機體內ROS的生成系統與抗氧化清除系統之間保持動態平衡，病理狀態下，二者之間平衡狀態被破壞，細胞內ROS增多，引起氧化應激。ROS能夠導致堿基發生突變，產生多種形式的DNA損傷，進而導致細胞死亡。大腦組織是人體所有組織器官中氧氣消耗最多的部位，ROS的增加會引起明顯的DNA氧化損傷和神經細胞死亡[12]。本研究結果顯示：4%和8%七氟醚處理后，HT22小鼠海馬神經元細胞中ROS水平升高，并與七氟醚的濃度呈依賴性。為進一步證實ROS與DNA損傷的相關性，預先給予抗氧化劑NAC后，HT22小鼠海馬神經元細胞再給予七氟醚處理，結果發現：NAC能夠明顯抑制七氟醚誘導的HT22小鼠海馬神經元細胞內ROS積聚、DNA損傷相關蛋白表達和DNA雙鏈損傷，減少HT22小鼠海馬神經元細胞死亡。本研究結果顯示：七氟醚通過促進海馬神經元細胞中ROS水平升高，導致DNA損傷相關蛋白表達增加，DNA雙鏈損傷，進而導致海馬神經元細胞死亡。研究[7，16-22]顯示：七氟醚能夠誘導發育期的大腦還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶和過氧化物酶的活化，抑制谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性，促進ROS的生成。研究[16-22]顯示：七氟醚暴露能夠增強新生鼠腦氧化應激反應，損傷線粒體，誘導ROS生成和海馬神經細胞死亡。

綜上所述，七氟醚能夠通過增加海馬神經元細胞中ROS積聚，誘導DNA損傷，進而導致海馬神經元細胞死亡。但本研究并未發現2%七氟醚具有明顯的神經毒性作用，且基于七氟醚的諸多優點，不否認七氟醚的臨床應用價值，仍需要進一步研究以確認七氟醚的神經毒性作用機制，以指導臨床應用。

*吉林大學臨床醫學專業2017級

△吉林大學臨床醫學專業2018級