龍膽生品及龍膽酒制品給藥后龍膽苦苷在大鼠主要器官組織中的濃度分布

吳曉燕，孫紫薇，侯曉琳，宿 瑩，劉 戰(zhàn)，孫 金，姜雨昕，翁麗麗

(長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室，吉林 長春 130117)

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽(GentianamanshuricKitag.)、龍膽(GentianascabraBge.)、三花龍膽(GenianatrifloraPall.)或堅(jiān)龍膽(GentianarigescerasFranch.)的干燥根及根莖[1]。龍膽為傳統(tǒng)常用大宗藥材，性味苦、寒；歸肝、膽經(jīng)；龍膽主要化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜類化合物，如龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、馬錢苷酸和獐牙菜苷等[2-4]，具有清火燥濕、瀉肝膽火、清熱健胃、改善脾胃消化功能、保護(hù)神經(jīng)中樞系統(tǒng)、抗炎和抗氧化等作用，可用于肝膽類疾病及高血壓等疾病的防治[5-7]，療效顯著，也是常用中成藥的原料藥。目前對(duì)于中藥龍膽的研究主要集中在其化學(xué)成分、臨床應(yīng)用和藥理作用等方面，近年對(duì)龍膽中的化學(xué)成分及炮制后有機(jī)成分的含量變化有一些研究[8-10]報(bào)道，但對(duì)其炮制前后主要化學(xué)成分在動(dòng)物主要器官組織中分布情況比較分析的研究少見報(bào)道。炮制是中藥加工過程中常用的傳統(tǒng)方法，適當(dāng)?shù)呐谥品椒ň哂懈淖兓蚓徍退幬镄阅埽魅趸蛳幬锊涣挤磻?yīng)，增強(qiáng)藥物療效等作用[9]。龍膽的炮制品包括酒制、甘草汁制、膽汁制、蜜制和生姜汁制等，目前臨床上廣泛應(yīng)用龍膽生品和龍膽酒制品[11-14]。龍膽酒制品在現(xiàn)代研究中多以增加有效成分提取率、提高生物利用度和制定相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為目的[15]。本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(high-performance liquid chromatography-mass spectrometry， HPLC-MS)法對(duì)龍膽生品及龍膽酒制品灌胃給藥后其主要藥效成分龍膽苦苷在大鼠主要器官組織中的分布進(jìn)行測(cè)定，探討其酒制前后龍膽苦苷在大鼠體內(nèi)分布的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自吉林省長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)2016-0003。甲酸為色譜級(jí)，乙腈為色譜級(jí)，均購自西隴科學(xué)股份有限公司；龍膽苦苷對(duì)照品(規(guī)格：20 mg，純度97.6%，批號(hào)：110770-201716，中國食品檢定研究院)。三重四級(jí)桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀LC-MC-8040[島津企業(yè)管理(中國)有限公司]，AUW120D分析天平(西安精大檢測(cè)設(shè)備有限公司)，F(xiàn)A1004B電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)，JA2603B電子天平(上海天美天平儀器有限公司)，TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 HPLC-MS法測(cè)定大鼠器官組織中龍膽苦苷

1.2.1 色譜條件 液相色譜條件：采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm，5-Micron)色譜柱，流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫(0～15.00 min，7%～40% A；15.00～15.01 min，40%～100% A；15.01～27.00 min，100% A；27.00～27.01 min，100%～7%A；27.01～30.00 min，7%A)；體積流量：1 mL·min-1；柱溫：35℃，進(jìn)樣量：10 μL。質(zhì)譜條件：采用負(fù)離子多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式下設(shè)定的離子對(duì)條件；電噴霧電離(ESI)Nebulizing Gas:3.0 L·min-1；Drying Gas Flow：15.0 L·min-1；DL Temperature：250℃；Heat Block Temp：400℃；CID Gas：230 kPa；MRM(-)龍膽苦苷m/z：401→59。

1.2.2 對(duì)照品溶液配制 取龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的對(duì)照品溶液。

1.2.3 水提液制備 樣品加水煎煮2次，每次1 h，過濾，合并2次濾液，濃縮至含生藥量0.1 g·mL-1的藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 給藥和組織樣品制備 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為龍膽生品組和龍膽酒制品組，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，按0.63 g·kg-1體質(zhì)量灌胃給藥，給藥后分別于15、30、60、120、240和360 min處死大鼠(每時(shí)間點(diǎn)10只大鼠，每組各5只)，迅速取出心、肝、脾、肺、腎和腦，用生理鹽水沖洗表面，吸干水分，稱質(zhì)量，加入2倍量冰生理鹽水，用組織勻漿器勻漿，即得組織勻漿液，-80℃保存，備用。

1.2.5 組織樣品處理 精密吸取大鼠組織勻漿液1.5 mL，置于10 mL離心管中，加入等體積甲醇，渦旋5 min，于2 000 r·min-1離心30 min，取出上清液備用，沉淀部分再次加入3 mL甲醇，渦旋5 min，于2 000 r·min-1離心30 min，合并2次濾液，于40℃水浴蒸干，殘留物用甲醇溶解，定容至1 mL，0.22 μm濾膜濾過，HPLC-MS法測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，記錄色譜圖和龍膽苦苷峰面積。

1.3 HPLC-MS方法學(xué)考察

1.3.1 專屬性 分別吸取空白組織和灌胃給藥后15 min時(shí)的肝組織樣品，在上述色譜和質(zhì)譜條件下測(cè)定，考察方法的專屬性。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 取空白組織勻漿1 mL，加入龍膽苦苷混合溶液，分別配制成濃度為50、150、2 500、5 000、10 000和20 000 μg·L-1的溶液，按“1.2.5”方法操作，進(jìn)行分析測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，以線性范圍最低濃度定為定量限。

1.3.3 精密度 精密度實(shí)驗(yàn)中，精密吸取1 mL空白肝臟組織勻漿，配制低、中和高3個(gè)濃度樣品(50、500和12 500 μg·L-1龍膽苦苷)的含藥組織樣品，按“1.2.5”操作，進(jìn)行分析測(cè)定，每日內(nèi)3組濃度各測(cè)6次，計(jì)算日內(nèi)精密度；3組濃度各6份，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度。

1.3.4 提取回收率 精密吸取1 mL空白肝臟組織勻漿，配制低、中和高3個(gè)濃度的3組質(zhì)量控制樣品(50、500和12 500 μg·L-1龍膽苦苷)，每個(gè)濃度進(jìn)行6樣本分析，按“1.2.5”操作，計(jì)算每組平均回收率。

1.3.5 穩(wěn)定性 吸取1 mL空白肝臟組織勻漿，精密加入龍膽苦苷對(duì)照品溶液，配制低、中和高3個(gè)濃度的3組質(zhì)量控制樣品(50、500和12 500 μg·L-1龍膽苦苷)，每個(gè)濃度平行處理5份，室溫下放置24 h、3次凍融循環(huán)和-80℃存放30 d后，按“1.2.5”操作，進(jìn)行分析測(cè)定，考察室溫、-80℃和反復(fù)凍融條件對(duì)組織樣品的影響。

1.4 龍膽生品及酒制品中龍膽苦苷在大鼠主要器官組織中質(zhì)量濃度檢測(cè)

將灌胃后15、30、60、120、240和360 min分離的各種組織制成勻漿，按“1.2.5”方法處理，測(cè)定大鼠組織樣品中質(zhì)量濃度，以外標(biāo)法計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)大鼠主要器官組織中龍膽苦苷的質(zhì)量濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 HPLC-MS法的專屬性

專屬性考察結(jié)果顯示：大鼠組織中內(nèi)源性物質(zhì)及其他成分均不干擾龍膽苦苷的測(cè)定。組織樣品以肝組織為例。見圖1～3。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

龍膽苦苷在50～20 000 μg·L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。見表1。

圖1 龍膽苦苷色譜圖

圖2 灌胃給藥15 min后肝組織樣品色譜圖

Fig.2 Chromatogram of liver tissue sample after intragastric administration for 15 min

圖3 空白肝組織樣品色譜圖

表1 龍膽苦苷在大鼠主要器官組織中的線性范圍和定量限

2.3 HPLC-MS法的精密度

測(cè)得日內(nèi)精密度的RSD分別為2.7%、2.9%和3.2%，日間精密度的RSD分別為9.4%、10.7%和10.6%。結(jié)果表明：該方法精密度良好，符合生物樣品分析精密度要求。

2.4 HPLC-MS法的提取回收率

各組平均回收率分別為87.2%、77.4%和80.1%，RSD分別為9.4%、10.7%和10.6%。結(jié)果表明：該方法提取回收率符合生物樣本分析的質(zhì)量控制要求。

2.5 HPLC-MS法的穩(wěn)定性

3個(gè)濃度質(zhì)量控制樣品測(cè)得的平均RSD值分別為7.93%、8.61%和8.06%，均小于10.00%。結(jié)果表明：龍膽苦苷在室溫、-80℃和反復(fù)凍融3個(gè)條件下較為穩(wěn)定。

2.6 龍膽生品及酒制品給藥后龍膽苦苷在大鼠主要器官組織中質(zhì)量濃度分布

大鼠灌胃給予龍膽生品及龍膽酒制品后，待測(cè)成分龍膽苦苷在大鼠體內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)(15、30、60、120、240和360 min) 各組織中的質(zhì)量濃度見表2。根據(jù)表2中各時(shí)間點(diǎn)龍膽苦苷在各組織中質(zhì)量濃度分布，計(jì)算其在不同器官組織中的藥-時(shí)曲線下面積(AUC0→360min)，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明：龍膽酒制前后其化學(xué)成分龍膽苦苷在大鼠心、肝、脾、肺、腎和腦組織中均有分布，在肝和腎組織中質(zhì)量濃度均明顯高于其他器官組織，且酒制后龍膽苦苷在大鼠肝、肺和腎組織中質(zhì)量濃度明顯升高(P<0.01)。

3 討 論

將龍膽生品及龍膽酒制品對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃給藥后，藥物在大鼠體內(nèi)迅速分布。給藥30 min后，在體內(nèi)即可檢測(cè)到較高的藥物濃度，在心、肝、脾、肺、腎和腦等組織中均檢測(cè)出龍膽苦苷，說明龍膽苦苷可以透過血腦屏障[16]。龍膽苦苷在肝和腎組織中分布明顯多于其他器官組織，這與《雷公炮制藥性解》中龍膽歸肝經(jīng)和腎經(jīng)的結(jié)論相一致。其中，龍膽苦苷含量在腎臟中達(dá)到最高，推測(cè)龍膽苦苷可能主要從腎臟排泄。《神農(nóng)本草經(jīng)》中曾記載：“龍膽若復(fù)以酒炮制之，則酒性走竄，無所不至，可助龍膽清除游走之肝火”。酒制能明顯改變龍膽苦苷在大鼠主要器官組織中的濃度分布情況，酒制后，龍膽苦苷在大鼠主要器官組織的質(zhì)量濃度分布整體呈增加趨勢(shì)，在肝、肺和腎組織中的分布明顯增加，在腦組織中有小幅度增加；在心和脾組織中龍膽苦苷的分布有較小幅度降低，但變化不大。這些結(jié)果表明酒制能夠增加龍膽苦苷的溶出度[17-21]，增加龍膽苦苷含量，促進(jìn)龍膽苦苷的吸收利用，為臨床合理用藥提供了參考依據(jù)。

表2 龍膽生品及酒制品給藥不同時(shí)間后龍膽苦苷在大鼠主要器官組織中的質(zhì)量濃度

Time(min)GroupMass concentration of gentiopicrinHeartLiverSpleenLungKidneyBrain15Raw products 171.8±14.3555.6±130.6299.1±22.5361.0±17.3786.8±20.1191.8±14.2Wine products149.9±8.4?1 142.1±161.3??375.5±31.9?225.3±25.4??3 637.1±203.1??245.4±17.3??30 Raw products928.5±12.51 113.7±48.5307.3±11.3696.3±23.19 673.6±1123.8234.0±6.3Wine products983.5±47.5?1 440.3±87.6??305.5±20.1857.6±45.2??7 927.1±75.7??725.2±68.3??60 Raw products386.3±20.81 850.7±20.71 265.1±56.1785.5±33.64 949.2±296.4293.4±7.8Wine products505.9±40.7?2 156.2±162.5??1 502.4±237.5 1 110.4±432.89 247.5±1 435.7??733.6±66.3??120Raw products312.5±24.81 433.3±118.7683.7±12.8597.5±36.21 641.9±187.1403.5±86.7Wine products219.1±55.8?1 815.9±63.4??525.9±112.0?720.3±16.4??4 006.6±315.2??563.0±21.4??240Raw products386.3±15.6213.1±13.9473.5±23.6230.8±31.81 060.5±237.5253.7±24.9Wine products167.8±61.4??446.5±47.5??146.1±33.2 511.0±35.6??1 506.4±24.7??107.3±10.6??360Raw products295.0±11.2120.7±15.7202.8±9.7260.9±14.0299.8±13.879.0±22.7Wine products190.0±71.8?188.0±35.2??196.5±11.9241.8±23.9 348.5±38.4?73.6±6.6

*P<0.05，**P<0.01vsgentian raw products group.

*P<0.05，**P<0.01 compared with gentian raw products group.

圖4 龍膽生品及酒制品灌胃給藥后龍膽苦苷在大鼠不同器官組織中平均AUC

Fig.4 Average AUC of gentiopicrin in different organs and tissues of rats after intragastric administration of gentian raw products and wine products

本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定龍膽苦苷在大鼠組織中含量的HPLC-MS法，并比較了龍膽生品及酒制品中龍膽苦苷在大鼠主要器官組織中分布的差異。HPLC-MS法簡便、快速、準(zhǔn)確，本研究為臨床應(yīng)用龍膽酒制品瀉肝膽火等疾病提供了科學(xué)依據(jù)，此外，更有助于進(jìn)一步探討龍膽藥材的炮制方法與其功效的相關(guān)性，提高龍膽藥材及其炮制品的有效利用率。